摘要
大脑是人体最重要的器官之一，其复杂且精密的神经系统网络为各项神经化学过程提供物质基础，以实现基本生理功能以及高级中枢活动。在众多脑神经化学物质中，谷氨酸是脑内分布最广的兴奋性神经递质之一，其浓度水平的基础值及动态变化与学习、记忆、癫痫、神经退行等诸多神经生理病理过程密切相关。在活体层次开展谷氨酸测量研究，将推动相关脑功能活动的分子机制探究，并为重大脑疾病的诊疗提供指导。目前，高时空分辨的谷氨酸分析方法主要围绕以谷氨酸氧化酶（GlutamateOxidase，GluOx）或谷氨酸脱氢酶（GlutamateDehydrogenase,GLDH）为元件的生物电化学传感展开，但这些方法在活体层次的谷氨酸检测中仍面临氧气或辅酶依赖、抗干扰能力差等问题。因此，本论文针对谷氨酸活体检测过程中的关键科学问题，从开发谷氨酸合成酶（Ferredoxin-dependentGlutamateSynthase,Fd-GltS）型传感新元件入手，为构筑高选择性生物电化学传感界面提出了计算模拟辅助的新策略，并发展了氧气不依赖、无需辅酶、抗干扰的谷氨酸传感新方法。具体研究内容如下: （1）氧气不依赖的谷氨酸电化学传感器的研究:受限于氧化酶、脱氢酶自身催化特性，传统生物电化学传感通常面临氧气或辅酶依赖的问题。对此，本研究提出以Fd-GltS为电化学传感元件的新思路。利用蛋白质重组策略，可将源自蓝藻细菌的Fd-GltS表达基因克隆至大肠杆菌表达系统，高效制备高纯度Fd-GltS重组蛋白。当溶液中存在高电位电子受体时，该酶可催化谷氨酸氧化反应，且无需氧气或外加辅酶参与。基于此，我们将Fd-GltS与二茂铁通过聚合物包裹共同固定于电极表面，制备了谷氨酸电化学传感器，实现了氧气不依赖、无需外加辅酶、高灵敏度的谷氨酸电化学传感。实验结果表明，基于Fd-GltS电催化的谷氨酸氧化反应可在较低电位下进行，而脑内多数电化学活性分子难以在此电位下发生共氧化，因此降低了对谷氨酸传感的干扰。这一研究表明，Fd-GltS作为一种新的谷氨酸传感元件，克服了酶基活体电化学传感所面临的氧气及辅酶依赖问题，具有用于谷氨酸的活体传感的潜力。 （2）计算机辅助的高选择性谷氨酸电化学传感器的研究:为了进一步提升Fd-GltS型传感界面的选择性和抗干扰能力，本研究聚焦于π-共轭（杂）环类小、分子介体在蛋白质内部的动力学，提出了计算机辅助“自上而下”构筑分子介导型生物电催化界面的新策略。首先构建了分子介体模板库（模板数＞100）,利用分子对接进行高通量虚拟筛选，建立了模板结构与电子转移距离、谷氨酸响应电流强度的“构效关系”。分子动力学研究结果表明，所筛选出的可旋转双环吲哚酚配体可在无需穿过底物/水通道的情况下，与蛋白质内部的核黄素催化活性中心发生高效的远距离电子转移。究其原因，蛋白质内部的氨基酸残基在吲哚酚配体的非稠合环上施加了具有偏向的氢键力，促使双环连接键旋转从而加强了分子的扭转行为，进而诱导分子取向快速改变和分子内轨道重构，在缩短电子转移距离的同时，减少了电子隧穿的动力学势垒。基于该策略构筑的生物电化学传感界面不仅具有较低的谷氨酸响应电位和高的抗干扰能力，而且有效避免介体分子对底物结合的竞争性抑制作用，拓展了谷氨酸检测浓度范围。本研究为构筑高性能酶基活体电化学传感界面提供了一种普适的策略。 （3）基于直接电子转移的谷氨酸传感方法探索:酶催化活性中心往往深埋于蛋白骨架内部，导致酶-电极界面电子转移效率低下，限制了酶电化学传感在活体原位分析领域中的应用。针对这一问题，本研究以建立无需介体的第三代谷氨酸电化学传感方法为目标，对Fd-GltS在碳纳米管修饰电极表面的直接电子转移行为进行了探究。我们先后发展了定点突变、化学交联及精氨酸电聚合策略，调控电极表面酶分子取向，观察到了Fd-GltS可通过其铁硫中心在碳纳米管表面表现出可逆的直接电子转移，在低电位下直接电催化谷氨酸的氧化，为实现无介体的谷氨酸电化学传感提供了可能。进一步，使用原电池型氧化还原电势法（Galvanicredoxpotential,GRP）通过电对的选择规避了氧气干扰的问题，并通过记录开路电位变化的方式实现了谷氨酸的传感。
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