摘要
目的:基于“固本清源”理论，从lncRNA抑制PI3K/Akt信号通路及激活自噬角度探索黄芪-全蝎及其主要活性成分抑制前列腺癌增殖、转移的作用机制。 方法:（1）基于网络药理学获取黄芪-全蝎与前列腺癌的共有靶点，对共有靶点分别进行PPI网络构建、活性成分-靶点-疾病网络构建、GO分析及KEGG通路富集分析，最后对主要潜在活性分子及靶点进行分子对接，预测其治疗前列腺癌的潜在信号通路。（2）体内实验通过构建LNCaP皮下移植瘤裸鼠，造模成功后分为7组:模型对照组，黄芪-全蝎药对低剂量组，黄芪-全蝎药对中剂量组，黄芪-全蝎药对高剂量组，黄芪治疗组，全蝎治疗组，多西他赛治疗组。干预结束后检测瘤体体积及重量、观察瘤体组织病理学、免疫荧光染色检测LC3表达情况、westernblot及RT-qPCR分别检测PI3K/Akt信号及自噬靶点LC3、Beclin1、P62蛋白及mRNA。（3）体外细胞实验:首先采用高效液相色谱-质谱（LC-MS）分析黄芪-全蝎抗肿瘤主要成分，然后将人前列腺癌细胞系LNCaP,随机分为5组:LNCaP组（空白组）、LNCaP+黄芪甲苷Ⅳ组、LNCaP+蝎毒多肽组、LNCaP+黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组、LNCaP+雷帕霉素组。干预24h后，进行CCK8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验、流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期、免疫荧光染色检测LC3表达情况、westernblot检测PI3K/Akt信号及自噬靶点LC3、Beclin1、P62蛋白。（4）将GSE155056的原始数据集下载到GEO数据库中，筛选得到前列腺癌差异表达lncRNA,然后采用正常前列腺上皮细胞RWPE-1及前列腺癌细胞LNCaP对前列腺癌差异性lncRNA进行生信验证，最后将LNCaP细胞分为4组:LNCaP组（空白组）、LNCaP+黄芪甲苷Ⅳ组、LNCaP+蝎毒多肽组，LNCaP+黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组，干预24h后采用RT-qPCR进行药物验证，筛选出一个具有差异表达lncRNA。（5）构建由sh-GDPD4-2稳定LNCaP皮下移植瘤裸鼠，造模成功后分为4组:分为sh-NC组、sh-GDPD4-2组、黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组和sh-GDPD4-2+黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组。将人前列腺癌细胞系LNCaP,随机分为4组:空白转染组、sh-GDPD4-2组、黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组、sh-GDPD4-2+黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组，干预24h后，进行CCK8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验、细胞凋亡检测、流式细胞周期检测、免疫荧光染色检测LC3表达情况、westernblot检测PI3K/Akt信号及自噬靶点LC3、Beclin1、P62蛋白、透射电镜观察细胞自噬体形态及检测各组裸鼠瘤体体积及重量。 结果:（1）基于网络药理学的研究方法，最终预测得到黄芪-全蝎药对治疗前列腺癌的27个有效成分、122个潜在作用靶点，主要富集在PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等。主要涉及RNA聚合酶启动、凋亡过程、DNA转录等生物过程。通过分子对接结果，黄芪-全蝎药对有效成分quercetin、kaempferol通过与PI3K/Akt信号通路中的关键靶点AKT1结合，选择性抑制该通路的激活，从而抑制前列腺癌细胞的增殖，可能是本研究中黄芪-全蝎药对治疗前列腺癌的重要分子机制之一。(2)经黄芪-全蝎药对高剂量组干预BALB/c裸鼠34天后，瘤体体积和重量明显低于模型对照组，且同样低于黄芪-全蝎药对低、中剂量组，呈剂量依赖性，提示黄芪-全蝎可较好地抑制瘤体的生长。病理组化证实，黄芪-全蝎药对高剂量组肿瘤核染色弱于对照组，细胞核较小，基质血管分布减少;免疫荧光测定显示，黄芪-全蝎可以上调前列腺癌组织中LC3的水平，提高自噬水平。从westernblot及RT-qPCR检测结果得知，黄芪-全蝎药对明显促进前列腺癌组织中LC3Ⅱ和Beclin1蛋白及mRNA的表达，显著抑制了前列腺癌组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和P62蛋白及mRNA的表达，提示黄芪-全蝎药对抑制前列腺癌裸鼠的肿瘤生长与抑制PI3K/AKT通路和促进自噬有关。(3)采用高效液相色谱结果证实了黄芪抗肿瘤主要成分为黄芪甲苷的存在，LC-MS/MS分析也证实了全蝎中存在独特的蝎毒多肽氨基酸序列BmK_AGAP和BmK_AngM1。细胞迁移实验中证实，黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽可以降低LNCaP细胞的迁移性;同时在细胞增殖、凋亡及周期实验中，我们发现黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组抑制前列腺癌LNCaP细胞的增殖，促进细胞凋亡，阻断细胞周期。免疫荧光测定显示，黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组可以上调LC3的水平，促进自噬。从westernblot检测结果得知，黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽明显上调LNCaP中LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达，下调了p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和P62蛋白的表达，这些结果提示，黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽作为黄芪-全蝎药对的主要活性成分，通过抑制PI3K/AKT信号和促进自噬抑制LNCaP细胞增殖和迁移。(4)在GSE155056原始表达矩阵中筛选出的差异表达lncRNA共1142个，其中lncRNAGDPD4-2、AC144450.1、LINC01513、AC004009.2、AL096869.1、AP005210.1和BX119924.1显著下调。进一步生信验证得知:与RWPE-1细胞比较，lncRNAGDPD4-2、AC144450.1、LINC01513、AC004009.2、AL096869.1和BX119924.1在LNCaP细胞中表达下调。经药物验证后，黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽组LNCaP细胞中GDPD4-2表达上调，与其他组相比具有差异性，提示黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽可上调GDPD4-2。(5)细胞增殖、迁移实验、凋亡及周期实验中证实，沉默GDPD4-2促进了LNCaP细胞的增殖、迁移及有丝分裂，抑制细胞凋亡，但通过黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽干预后可逆转LNCaP细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡，阻断细胞周期。免疫荧光测定显示，沉默GDPD4-2抑制LNCaP细胞中LC3蛋白的表达，通过黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽干预后可促进LNCaP细胞中LC3蛋白的表达。从westernblot检测结果得知，沉默GDPD4-2可促进PI3K/AKT信号及抑制自噬，通过黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽干预后可逆转对PI3K/AKT信号的促进作用，恢复LNCaP细胞的自噬。从透射电镜观察结果得知，黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽通过GDPD4-2调节LNCaP细胞自噬。从分析肿瘤体积和肿瘤重量得知:沉默GDPD4-2逆转了黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽对瘤体的抑制作用，说明黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽可通过GDPD4-2途径抑制瘤体进展。 结论:黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽作为黄芪-全蝎抗前列腺癌的药效成分，通过调节lncRNAGDPD4-2抑制PI3K/AKT信号及激活自噬的途径，抑制前列腺癌增殖和转移。
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