摘要
研究目的: 肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，其中约85％为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma,NSCLC)。尽管靶向和免疫治疗的出现极大地提高了NSCLC患者的疗效，但其仍然是癌症相关死亡的首要原因。基于光敏剂(photosensitizer)的光热(photothermaltherapy,PTT)联合光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)为NSCLC患者提供了新的治疗选择。然而，临床上常用的光敏剂吲哚菁绿(indocyaninegreen,ICG)对肺癌细胞缺乏特异性。因此，ICG作为光敏剂应用于光热治疗与光动力治疗受到一定的限制。临床研究发现，约80％-85％的NSCLC中存在表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)的高表达。因此，本研究旨在构建能够有效靶向EGFR的纳米颗粒以提高对NSCLC的精准识别及靶向光热与光动力治疗。 研究方法: (1)制备及表征ICG-Osi纳米颗粒 本研究采用自组装方法，利用ICG和奥西替尼Π-Π堆积的结合方式制备成ICG-Osi纳米复合物。通过Malvern粒径仪分析ICG-Osi的粒径及电位;通过透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscopy,TEM)检测ICG-Osi的形态及大小;通过紫外分光光度计与荧光分光光度计分别检测ICG-Osi的紫外吸收性能和荧光吸收性能;通过体外荧光试验和光热试验分别检测ICG-Osi的荧光成像能力和光热性能。 (2)验证ICG-Osi纳米颗粒对EGFR的靶向性 首先通过蛋白免疫印迹方法检测不同肺癌细胞系中EGFR的表达水平，然后根据EGFR的蛋白表达量将肺癌细胞系分为EGFR阳性组和EGFR阴性组。继之，通过免疫荧光和流式细胞术观察ICG-Osi对不同肺癌细胞系的识别及靶向能力。最后构建EGFR阳性肺癌细胞的小鼠皮下瘤模型，将ICG-Osi通过小鼠尾静脉注入小鼠体内，然后观察小鼠体内的荧光分布情况，以进一步验证ICG-Osi纳米颗粒对EGFR阳性肺癌细胞的体内靶向性。 (3)验证ICG-Osi纳米颗粒的靶向光热与光动力疗效 首先应用CCK-8细胞活性试验、CalceinAM-PI活死细胞染色试验、活性氧(ROS)检测实验在体外验证ICG-Osi纳米颗粒对EGFR阳性NSCLC的抑制及杀伤作用。进一步在荷瘤小鼠体内注射ICG-Osi溶液，并联用近红外光照射其肿瘤部位，通过持续监测小鼠的肿瘤体积来判断ICG-Osi纳米颗粒对NSCLC的抑制及杀伤作用。 (4)探究ICG-Osi纳米颗粒介导的细胞死亡途径 采用蛋白免疫印迹方法检测不同细胞死亡通路中关键蛋白的表达情况，如凋亡关键蛋白Caspase-3、自噬关键蛋白P62、Beclin1、铁死亡关键蛋白GPX4等。同时检测凋亡标记物TUNEL以协同阐明ICG-Osi纳米颗粒引起NSCLC死亡的主要途径。 (5)验证ICG-Osi纳米颗粒的生物安全性 采用CCK-8法检测正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)的活性，同时监测小鼠体重、检测小鼠血清生化指标、分析小鼠重要脏器的损伤情况以验证ICG-Osi纳米颗粒在体内外的生物安全性。 研究结果: (1)ICG-Osi纳米颗粒具备良好的荧光及光热性能 本研究通过Π-Π堆积的结合方式成功地将ICG与奥西替尼自组装形成ICG-Osi复合物。通过对ICG-Osi基本性能的检测，我们发现ICG-Osi是大小为276nm,表面电位为-7.6mV的球形纳米颗粒。同时，通过荧光吸收光谱及体外光热试验我们发现该纳米颗粒具备良好的荧光成像性能及光热效应，能很好的应用于后期的荧光成像及光热治疗实验。 (2)ICG-Osi纳米颗粒能特异识别及靶向EGFR阳性的肺癌细胞 本研究发现ICG-Osi纳米颗粒在体外能特异识别及靶向EGFR阳性的肺癌细胞，并且流式细胞术显示其阳性率均达到75％以上，而对于EGFR阴性的肺癌细胞几乎不靶向或低靶向，其阳性率不到30％。同时，ICG-Osi纳米颗粒在体内也能显著富集到EGFR阳性肺癌细胞部位并且持续时间较长。以上结果表明了ICG-Osi纳米颗粒能有效针对EGFR靶点进行特异识别及靶向。 (3)ICG-Osi纳米颗粒能有效抑制EGFR阳性肺癌细胞增殖与生长 本研究发现ICG-Osi纳米颗粒在体外能有效抑制肺癌细胞H1975增殖，并且通过产生大量活性氧促进H1975细胞死亡。同时，ICG-Osi在体内也能有效抑制小鼠肿瘤细胞生长，起到有效的体内抑癌作用。 (4)ICG-Osi纳米颗粒能通过多种途径诱导肺癌细胞死亡 本研究发现ICG-Osi纳米颗粒可以上调凋亡关键蛋白Caspase-3和自噬关键蛋白Beclin1表达，下调P62和铁死亡关键蛋白GPX4表达，同时增加TUNEL阳性率。提示ICG-Osi纳米颗粒能通过多种细胞死亡途径诱导肺癌细胞死亡。 (5)ICG-Osi纳米颗粒具备较高的体内外生物安全性 本研究发现ICG-Osi纳米颗粒对正常细胞未显示其毒性作用，也不影响正常细胞生长。同时，发现ICG-Osi不影响小鼠体重、肝肾功能(ALT、AST、ALP、BUN、CREA)等主要脏器组织，证明了ICG-Osi纳米颗粒在体内外都具有较高的生物安全性。 结论: 综上所述，我们制备的一种基于ICG与奥西替尼自组装的多功能纳米颗粒(ICG-Osi),其合成方法简单可行，具有荧光成像和光热治疗潜能，在体外及体内均能特异靶向识别和结合EGFR阳性肺癌细胞，在体内外通过多种信号通路促进肿瘤细胞死亡，并具备较高的生物安全性。今后，这一纳米药物对治疗EGFR阳性肺癌患者有一定的应用潜能。
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