摘要
冻土是指温度低于0℃，并含有一定量冰的土壤或岩石，它们分布在地表下一定深度范围内。根据冻土的形成条件、性质和分布特征，可以将其分为多年冻土、季节性冻土等类型。多年冻土是指至少连续两年以上保持冻结状态的冻土，而季节性冻土则是指每年的某个时期会发生冻融变化的冻土。由于冻土独特的地理与气候特征，各种形态的具有独特生物活性的微生物生活在其中，这些微生物已经存活了几千年甚至几百万年，具有独特的遗传学特征和适应环境的生理生化机制。冻土微生物研究是一个新兴的领域，它不仅对探讨地球上最早期生命起源及其演化具有重要意义，而且对微生物多样性的保护和利用、对古气候的重建、微生物生物安全、生物基因的进化、宇宙生物学的研究、全球环境变化等方面都有重要价值。近年来，由于气候变化，冻土融化，在一定程度上促进了冻土中的微生物活动，进而增加了温室气体排放的可能性，也增加了致病微生物进入人类生活环境的风险。快速的气候变暖可能会使冻土中长期封存的有机碳被微生物分解释放，进一步加剧气候变暖。开展冻土微生物的研究将为我们更好地理解和应对这些问题提供新的途径。 本研究旨在系统地研究冻土微生物的种类与生物安全风险。为此，我们首先建立了生物信息分析平台，可以满足宏基因组分析、病毒序列挖掘、生物信息相关软件开发等多种数据分析需求。然后我们从青藏高原祁连山冻土区收集了24个活动层样本与150个永冻层样本，并进行了高通量测序、宏基因组与宏病毒组学分析。我们分析了青藏高原活动层冻土的细菌组成，发现青藏高原多年冻土环境微生物以放线菌与变形菌为主。分析了冻融作用对微生物相对丰度的影响，发现不同种类的微生物对环境的响应机制不同，酸杆菌门细菌相对于其他细菌更耐受冻结的胁迫。分析了冻融与冻结作用对冻土微生物多样性的影响，多种多样性评估结果表明冻融与冻结作用并不会影响冻土微生物的多样性。除了在组学层面对冻土微生物整体的组成与多样性，我们还对冻土微生物蛋白质组的生物安全做了评估。我们发现冻土中存在大量胆固醇依赖的细胞溶素(Cholesterol-dependentcytolysins,CDCs)蛋白家族成员。通过结构预测的冻土细胞溶素与已知的病原微生物细胞溶素比较，我们发现冻土细胞溶素具有与病原微生物细胞溶素相似的N端结构，并且部分冻土蛋白保留有完整的胆固醇结合基序与胆固醇识别基序，具有一定的生物安全风险。 除了对冻土微生物细菌部分的研究外，我们还通过宏病毒组学分析方法挖掘出大量永冻层土壤中的病毒序列，发现大部分序列无法与现有的病毒序列比对成功，这说明我们对病毒在整个生态系统中扮演的角色还不够了解。通过文献调研，我们发现尚无公认的RNA病毒序列挖掘流程，为此，建立在多种病毒序列挖掘流程的基础上，我们建立了新的RNA病毒挖掘流程并开发了相关的RNA病毒序列处理软件。 本论文系统地研究了冻土微生物的识别方法和生物安全风险，发现青藏高原冻土细菌组成以放线菌门与变形菌门为主，冻土病毒以噬菌体为主，存在大量的无法注释病毒序列。发现冻土微生物中存在胆固醇依赖性细胞溶素的基因，通过结构预测发现该基因对应蛋白的胆固醇结合与识别基序是保守的，存在致病风险，推动了我们对冻土微生物生物安全的理解。优化了环境RNA病毒挖掘流程，减少了细胞转录产物对RNA病毒挖掘产生的影响，为未来评估环境微生物生物安全和研究环境RNA病毒的种类和功能奠定了坚实的基础。
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