摘要
嗜虫书虱Liposcelisentomophila(Enderlein)属于啮虫目(Psocoptera)书虱科(Liposcelidae)，其体型小、适应性强、食性杂和繁殖快等特点使其常爆发成灾，严重威胁粮食储藏安全。作为粮库中常见的害虫，嗜虫书虱特殊的生物学特性和极强的环境抗逆性，对多种化学药剂产生了抗性，尤其是对磷化氢产生耐受性，并且对目前“双低”储藏的绿色技术也已经产生了较为明显的生殖适应性，成为了最难彻底杀灭的储粮虫种之一。因此，探索嗜虫书虱新的防治方式和开发新型特异性杀虫技术显得尤为迫切。 胰岛素(Insulin)是一种在昆虫中进化保守的多功能肽激素。胰岛素信号(Insulinsignaling)通路因广泛参与昆虫的生长发育、繁殖、物质代谢、衰老和寿命等生理过程而备受研究。以调控昆虫卵黄发生的胰岛素信号入手，探讨胰岛素信号中关键基因和JH信号通路协同调控嗜虫书虱卵黄发生的分子机制，筛选调控嗜虫书虱卵黄发生的关键基因并明确其分子机理为害虫防控提供了新思路和新方向。因此，本研究首先用外源性牛胰岛素确定胰岛素提高嗜虫书虱雌成虫LeVg的表达量并促进了产卵，这表明LeILP在嗜虫书虱的生殖过程中起重要作用;克隆并验证具体是哪些ILP调控嗜虫书虱卵黄发生;之后克隆并解析嗜虫书虱胰岛素信号下游，有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphotidylinositol3-kinase,PI3K)两条通路中的关键基因LeERK和LeAkt,分别探究其在嗜虫书虱卵黄发生过程中的作用，首次提出胰岛素信号途径中LeAkt基因影响JH的合成来共同调控书虱卵黄发生以及卵巢发育。详细研究结果如下: (1)外源性胰岛素诱导对嗜虫书虱产卵的促进作用 采用外源性牛胰岛素来探究胰岛素对嗜虫书虱产卵的影响。结果表明，与对照(HEPES缓冲液处理)相比，高浓度牛胰岛素(100μg/μL)处理后1周内观察到嗜虫书虱雌成虫死亡率不断增加且比低浓度(0.1、1.0和10μg/μL)处理死亡率更大(达到51.88％)。使用1.0μg/μL牛胰岛素注射处理能够显著促进嗜虫书虱雌成虫产卵，使得嗜虫书虱雌成虫在未来两周内持续产卵且总产卵量高于处理组。证明了胰岛素信号参与嗜虫书虱卵黄发生的调控。 (2)胰岛素信号中3个LeILP基因对嗜虫书虱卵黄发生的调控作用 基于课题组已经建立的嗜虫书虱转录组数据库，首次从嗜虫书虱中克隆获得3个胰岛素样肽，通过鉴定确定为LeILP1,LeILP2和LeILP7。LeILP1,LeILP2和LeILP7的CDS序列长度分别为471，381和420bp，编码157，127和140个氨基酸。编码蛋白的分子量为37.96,30.79,34.13kDa;等电点为8.383，9.562,8.56。LeILP1,LeILP2和LeILP7属于胰岛素超家族，具有高度的结构保守性，其前体包括信号肽、B链、相互连接的C肽和A链。其中，LeILP7的C端延伸是胰岛素生长因子（IGFs）的特征。LeILP1,LeILP2和LeILP7在嗜虫书虱所有检测的各个发育龄期都有特异性表达。但在不同发育阶段其相对表达量之间差异显著（P＜0.05）。LeILP1和LeILP2基因在第7日龄的雌成虫期较若虫期相对表达量均为较高;而LeILP7在若虫期的表达较成虫期高。LeILP1在头部表达最高，中肠中的表达次之;LeILP2和LeILP7均为在头部中的表达量最高，胸部次之。外源胰岛素处理6小时后LeILP1,LeILP2,LeILP7的转录水平较对照组分别显著上调19.4,20.1和35.6倍。通过对嗜虫书虱分别持续饲喂dsLeILP1,dsLeILP2和dsLeILP7,这些基因的转录水平得到有效抑制，其中只有取食dsLeILP2的嗜虫书虱出现Vg的表达显著下调，卵巢发育不健全，产卵量和孵化率显著减少的现象。说明了LeILP2在嗜虫书虱卵黄发生过程中起重要调控作用。 （3）胰岛素信号下游MAPK通路中LeERK基因对嗜虫书虱卵黄发生的调控作用 克隆获得嗜虫书虱胰岛素信号通路中细胞外调节蛋白激酶LeERK基因的CDS序列，长为1107bp，编码368个氨基酸。分子量和等电点分别为42.4kDa和6.14。推导的氨基酸序列分析表明，属于丝氨酸或苏氨酸特异性激酶亚家族。系统发育分析表明，膜翅目、鞘翅目、鳞翅目和双翅目昆虫的ERK基因在进化树上形成4个独立的分支，其中嗜虫书虱与膜翅目和鞘翅目昆虫的ERK基因亲缘关系较近。LeERK在嗜虫书虱所有检测的各个发育龄期都有特异性表达，但在不同发育阶段其相对表达量之间差异显著（P＜0.05）。LeERK在第7日龄的雌性成虫较若虫期相对表达量较高，在头部中特异性高表达，卵巢中次之。外源胰岛素处理12小时后LeERK的转录水平较对照组显著上调4.75倍。通过持续饲喂dsLeERK,有效抑制嗜虫书虱LeERK基因的转录水平，抑制了LeVg的合成，导致卵巢管不完全发育，卵巢成熟受到抑制，产卵量和孵化率显著下降，降低书虱正常的生殖能力。说明嗜虫书虱胰岛素信号途径中LeERK基因在嗜虫书虱卵黄蛋白的合成起到了重要作用。 （4）胰岛素信号下游PI3K通路中LeAkt基因对JH合成和嗜虫书虱卵黄发生的调控作用 克隆获得了嗜虫书虱胰岛素信号通路中蛋白激酶BLeAkt基因的CDS序列，长为1587bp,编码529个氨基酸。分子量和等电点分别为59.43kDa和5.81。LeAkt蛋白结构域高度保守，属于丝氨酸或苏氨酸特异性激酶亚家族。LeAkt与半翅目昆虫的Akts氨基酸序列的一致性较高，这与嗜虫书虱作为渐变态昆虫与昆虫纲中的分类关系相同。LeAkt在嗜虫书虱雌成虫各个发育龄期都有特异性表达，第7和13龄的中相对表达量为最高，雌性成虫期较若虫期相对表达量高，LeAkt在头部和卵巢中特异性高表达，暗示LeAkt的功能与卵巢发育有关。外源胰岛素处理12h显著上调了LeAkt的表达3.49倍。通过持续饲喂dsLeAkt，有效抑制嗜虫书虱LeAkt基因的转录水平，抑制了Vg的合成，导致卵巢管发育不完全，说明LeAkt对嗜虫书虱卵黄发生和卵巢发育起重要调控作用。沉默嗜虫书虱LeAkt降低了JH-Ⅲ的滴度，抑制了JH的合成，从而降低书虱正常的生殖能力。在干扰过程中还因激素传导受阻造成一定程度的死亡率。另外，本研究还对LeAkt基因与JH信号通路关键基因的交互作用进行了探讨，沉默嗜虫书虱LeAkt后JH生物合成基因（LeJHAMT)的表达显著降低;JH受体基因(LeMet)和下游转录因子(LeKr-h1)被显著抑制;两个JH降解基因（LeJHE和LeJHEH)的表达显著增加。这再次表明嗜虫书虱胰岛素途径的激活对JH合成是必要的，卵黄发生与生殖过程由胰岛素信号通路和JH协同调控。然而，胰岛素通路与JH信号通路的相互作用是如何调控嗜虫书虱生殖的，还需要进一步阐明。
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