摘要
肠杆菌目细菌是引起医院获得性感染最重要的病原菌之一，随着多重耐药肠杆菌目细菌在临床上的不断出现和流行播散，传统抗菌药物如青霉素，头孢菌素，酶抑制剂复合制剂等逐渐不能满足临床需求。碳青霉烯类抗菌药物如美罗培南与亚胺培南等是目前治疗多重耐药肠杆菌目细菌引起感染最主要的抗菌药物之一。随着碳青霉烯类药物在临床上的广泛应用，碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌在临床上的检出逐渐增多。根据2005年至2022年“CHINET中国细菌耐药监测网”数据显示，在肠杆菌目细菌中，检出率排第二的肺炎克雷伯菌，对亚胺培南与美罗培南的耐药率从2005年的3％和2.9％快速上升至2022年的26％和27.5％。碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（Carbapenem-resistantEnterobacterales,CRE）除了检出率不断上升，其所致感染给病人也带来了重大威胁。研究显示，成人患者CRE感染的死亡率高达30％-50％，新生儿碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染患者的死亡率高达64％。CRE被认为是世界上最严重的抗菌药物耐药性问题之一，该菌被美国疾病控制和预防中心以及世界卫生组织列为全球公共卫生的重大威胁。 CRE对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制包括产碳青霉烯酶、产AmpC酶或ESBLs酶合并膜孔蛋白（OmpK35,OmpK36等）缺失或低表达以及外排泵等的过度表达等。在这些机制中，产碳青霉烯酶是最主要的，包括AmblerA类产丝氨酸碳青霉烯酶:KPC酶（主要），IMI酶，SME酶等;B类金属β-内酰胺酶:NDM酶、VIM酶和IMP酶等;以及D类OXA-48型碳青霉烯酶:OXA-232酶和OXA-181酶等。在我国目前分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌中，主要以携带blaKPC-2基因的菌株为主。KPC-2型碳青霉烯酶几乎可以水解所有的头孢菌素和碳青霉烯类抗菌药物，导致治疗选择十分有限。目前，替加环素、多黏菌素和头孢他啶-阿维巴坦（主要用于产KPC酶菌株所致感染的治疗）是临床治疗CRE所致感染最后可选的三种药物。随着头孢他啶-阿维巴坦于2019年在我国获批上市用于临床，近年来头孢他啶-阿维巴坦耐药菌株的检出率开始增加。在已报道的耐药机制中，源自blaKPC-2或blaKPC-3基因的突变而出现blaKPC新基因亚型是主要原因，通常会导致高水平耐药以及随后的治疗失败。更重要的是，过去2年内新发现的blaKPC新基因亚型数量超过了过去20年的数量之和。迄今为止，根据NCBI数据库所公布的数据，全世界已报道140多种blaKPC新基因亚型。中国报道的大多数blaKPC新基因亚型是从blaKPC-2突变而来，而欧洲报道的主要来自blaKPC-3。blaKPC新基因亚型阳性菌株的出现加剧了目前的抗菌药物耐药性问题，迫使我们寻找新的抗菌药物如氨曲南-阿维巴坦、美罗培南-韦博巴坦和头孢地尔等来应对这些新现耐药细菌所致感染的治疗。本课题获得了国家自然科学基金《新KPC型碳青霉烯酶基因亚型的筛选、克隆和功能研究》，和国家自然科学基金《重要耐药菌/耐药基因在“动物-环境-人群”链条中的传播机制和风险研究》的资助，项目编号为82172311和32141002。 本研究聚焦于中国临床分离的肺炎克雷伯菌中blaKPC新基因亚型的筛选、传播机制和功能研究。本研究主要包括以下三个部分: 第一部分肺炎克雷伯菌对头孢他啶-阿维巴坦的敏感性及blaKPC新基因亚型的筛选 目的:通过对2021年国内分离的肺炎克雷伯菌进行包括头孢他啶-阿维巴坦在内的抗菌药物敏感性试验，了解肺炎克雷伯菌对常用及新型抗菌药物的敏感性，通过PCR及Sanger测序明确肺炎克雷伯菌中blaKPC新基因亚型的分布特征。 方法:收集2021.01-2021.12全国分离的肺炎克雷伯菌，采用肉汤微量稀释法测定头孢他啶-阿维巴坦等药物对肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration,MIC),采用PCR试验及Sanger测序检测头孢他啶-阿维巴坦耐药菌株中的blaKPC新基因亚型。 结果:全国范围内共收集4819株肺炎克雷伯菌临床分离株。标本来源主要为痰液(57.7％)，尿液(12.3％)和血液(10.4％)，主要分布于ICU(31.2％)、神经外科(11.4％)和呼吸内科(7.9％)。药物敏感性试验结果显示，4819株肺炎克雷伯菌对氨曲南-阿维巴坦(敏感率=96.4％)、多黏菌素B(敏感率=94.0％)、多黏菌素E(敏感率=93.9％)和替加环素(敏感率=90.3％)表现出高度敏感性，其次是头孢他啶-阿维巴坦(敏感率=86.5％)、亚胺培南-瑞来巴坦(敏感率=71.9％)和复方磺胺甲噁唑(敏感率=39.2％)。共652(652/4819,13.5％)株细菌对头孢他啶-阿维巴坦耐药。652株头孢他啶-阿维巴坦耐药肺炎克雷伯菌中，碳青霉烯酶基因型以blaNDM(331/652,50.8％)为主，包括blaNDM-1(185/652,28.4％)和blaNDM-5(146/652,22.4％)。19株细菌携带blaIMP(blaIMP-4,14/652,2.1％;blaIMP-26,3/652,0.5％;b/aIMP-8,2/652,0.3％)，2株携带blaVIM(blaVIM-1,2/652,0.3％)。共鉴定出30种blaKPC新基因亚型，以b/aKPC-33为主(14/30,46.47％)，其次为blaKPC-112(6/30,20％)、blaKPC-71(5/30,16.7％)、b/aKPC-100(1/30,3.3％)、blaKPC-127(1/30,3.3％)、b/aKPC-128(1/30,3.3％)、blaKPC-135(1/30,3.3％)和blaKPC-136(1/30,3.3％)。氨曲南-阿维巴坦、替加环素、多黏菌素B和多黏菌素E对blaKPC新基因亚型阳性菌株具有高度抗菌活性(敏感率＞90％)。与blaKPC-2阳性菌株相比，大部分blaKPC新基因亚型阳性菌株的药敏谱变化特征为对头孢他啶-阿维巴坦的耐药性明显升高，同时恢复对碳青霉烯类药物的敏感性。 结论:4819株肺炎克雷伯菌对头孢他啶-阿维巴坦的耐药率为13.5％,共30种blaKPC新基因亚型，以blaKPC-33为主(14/30,46.47％)，其次为blaKPC-112(6/30,20％)、blaKPC-71(5/30,16.7％)、blaKPC-100(1/30,3.3％)、blaKPC-127(1/30,3.3％)、blaKPC-128(1/30,3.3％)、blaKPC-135(1/30,3.3％)和blaKPC-136(1/30,3.3％)。blaKPC-112、blaKPC-127、blaKPC-128、blaKPC-135和blaKPC-136为本课题组发现并进行报道。 第二部分blaKPC新基因亚型的传播机制研究 目的:了解blaKPC新基因亚型的突变特点与遗传环境，了解传播机制。 方法:以blaKPC新基因亚型为研究对象。结合全基因组测序技术（WGS）与生物信息学方法等，研究blaKPC新基因亚型的遗传环境，分析其传播机制。 结果:与blaKPC-2相比，blaKPC新基因亚型的突变位点主要集中于KPC蛋白结构的Ω环内部（164-179位），表现为对头孢他啶-阿维巴坦耐药，blaKPC-112、blaKPC-128、blaKPC-135在KPC蛋白Ω环突变的基础上同时存在237-243或267-275的突变。本研究首次报道的几种blaKPC新基因亚型的具体突变位点以及突变前后的氨基酸信息汇总如下:blaKPC-112:167delEL+241delGTA;blaKPC-127:dup169EL+172A＞T;blaKPC-128:179D＞Y+243T＞M;blaKPC-135:167delEL+272_273insAVYTRAPNKDDKHSE;blaKPC-136:174P＞L。 遗传环境分析显示，与国内报道的blaKPC-2的遗传环境基本相同。除blaKPC-135外，所有blaKPC新基因亚型均位于以Tn1721及IS26为核心的转座元件:Tn1721-△ISKpn6-blaKPC-ISKpn8-△tnpR-IS26。Tn1721包括两个38-bp的末端反向重复序列（IRR:右侧反向重复序列和IRL:左侧反向重复序列）、转座酶（TnpA）和分解酶（TnpR）组成。blaKPC-135中，IS26替代Tn1721,构成由两侧IS26介导的全新遗传环境:IS26-△ISKpn6-blaKPC-135-ISKpn8-△tnpR-IS26。通过序列对比，我们猜测△ISKpn6-blaKPC-135-ISKpn8-△tnpR片段通过IS26从Tn6296获得。测序结果显示，blaKPC新基因亚型均位于约94～150kb的lncFⅡ型质粒，携带blaCTX-M,blaTEM,blaSHV,rmtB和fosA3等耐药基因。膜孔蛋白OmpK35与OmpK36均发生了突变:OmpK35的第55位插入一个核苷酸，导致第67位过早终止密码子产生截短的蛋白质，OmpK36的跨膜β-链环存在GD（Gly115-Asp116）插入，blaKPC-136菌株的OmpK36在L4环存在额外的LSP（Leu165-Ser-Pro167）插入。 结论:与blaKPC-2相比，blaKPC新基因亚型的突变位点主要集中于KPC蛋白Ω环内（164-179位），部分同时发生其他部位的突变，除blaKPC-135外，所有blaKPC新基因亚型均位于以Tn1721及IS26为核心的转座元件。blaKPC-135中，Tn1721丢失，由IS26替代，构成由两侧IS26介导的6498bp的全新遗传环境:IS26-△ISKpn6-blaKPC-135-ISKpn8-△tnpR-IS26。 第三部分KPC新基因亚型蛋白的功能研究 目的:研究KPC新基因亚型蛋白在介导肺炎克雷伯菌对头孢他啶-阿维巴坦耐药中的功能。 方法:以blaKPC-112（OM177660）、blaKPC-127（ON521725）、blaKPC-128（ON521727）、blaKPC-135（OP205646）和blaKPC-136（OP380273）阳性肺炎克雷伯菌为研究对象，采用分子克隆实验对blaKPC新基因亚型的表型进行验证。同时构建表达载体，体外对KPC新基因亚型酶的活性进行检测，确定酶促反应的测定条件，对KPC新基因亚型酶的酶促反应动力学特征进行研究。 结果:与携带空载体的DH5α相比，所有blaKPC新基因亚型均可介导克隆株对头孢他啶-阿维巴坦的MIC值上升（32～512倍），对于亚胺培南与美罗培南，肺炎克雷伯菌K2（blaKPC-112阳性）、K3（blaKPC-127阳性）、K4（blaKPC-128阳性）和K5（blaKPC-135阳性）MIC值基本无变化，K6（blaKPC-136阳性）MIC值上升了32倍。酶促反应动力学结果显示，KPC-112、KPC-127、KPC-128和KPC-135酶对亚胺培南和美罗培南基本无催化活性，仅KPC-136酶对亚胺培南和美罗培南表现出较强的催化活性。与KPC-2酶相比，KPC新基因亚型酶对头孢他啶的亲和力均增强（Km值增加），仅KPC-112及KPC-136酶表现为对头孢他啶的水解能力增强。结合克隆株药敏,推测亲和力的增加是KPC新基因亚型酶介导细菌对头孢他啶耐药的主要原因。阿维巴坦对所有KPC新基因亚型酶的IC50值均比KPC-2酶明显增高，提示blaKPC新基因亚型蛋白与阿维巴坦的亲和力低。 结论:blaKPC-112、blaKPC-127、blaKPC-128、blaKPC-135及blaKPC-136介导了头孢他啶-阿维巴坦MIC值的升高。KPC-112、KPC-127、KPC-128及KPC-135蛋白对碳青霉烯类药物基本无催化活性，而KPC-136蛋白对碳青霉烯类药物保留了与KPC-2蛋白接近的亲和力与催化活性。blaKPC新基因亚型中出现的头孢他啶-阿维巴坦耐药性与对头孢他啶的高亲和力和对阿维巴坦的敏感性降低有关。
NETL