摘要
酶疗法是一种新兴且具有广泛应用前景的肿瘤治疗策略。葡萄糖氧化酶（GOx）可特异性消耗糖酵解底物（葡萄糖）产生过氧化氢（H2O2）和葡萄糖酸，从而阻断肿瘤细胞内的糖酵解代谢通路，因此可用于肿瘤饥饿治疗。虽然，GOx基纳米药物的构建及其在癌症治疗领域中的应用，引起了研究学者们广泛的关注。然而，一方面，GOx作为蛋白质酶，具有稳定性差、半衰期短、生物利用度低和安全性弱的缺点，且难以被细胞所摄取，严重限制了其在癌症治疗中的应用。另一方面，额外的载体一般难以被机体降解且具有代谢负担。因此，本论文以GOx自身为载体，合成了GOx基纳米药物用于GOx和疏水小分子药物的共递送、酶活性的智能调控以及肿瘤治疗研究。具体研究内容与创新性如下: （1）酸响应型GOx基纳米平台的构建及其肿瘤治疗研究 针对GOx静脉给药时的毒性和额外递送载体的代谢负担的科学问题，本研究从GOx自身为载体出发，设计和构建了一种酸激活的GOx基纳米平台（GOxNPs），用于实现疏水性小分子药物与GOx高效的肿瘤递送和全身给药酶活性的智能调控。利用疏水相互作用和蛋白质自组装技术，GOx可分别与多种小分子药物形成粒径均一、稳定性良好的纳米药物。小分子药物进入GOx的疏水口袋，导致酶催化位点被封闭。相较于游离的GOx,GOxNPs对血糖影响不明显，且GOx的最大耐受剂量从50mgkg-1增加至80mgkg-1,显著提高了GOx的生物安全性。GOxNPs到达肿瘤组织后，酸性的肿瘤微环境改变了酶的二级结构，促使其降解并恢复酶的活性，从而实现GOx活性的智能调控。同时，所负载的疏水性药物被有效释放并发挥疗效。经验证，GOx与索拉非尼（SRF）、有机吡啶配体修饰花菁类分子（tPy-Cy）或紫杉醇（PTX）形成的纳米药物（SRF@GOx、tPy-Cy@GOx和PTX@GOx）,分别实现了抗肿瘤饥饿与铁死亡/光热治疗（PTT）/化疗的联合治疗。因此，本研究所开发的GOx自载体纳米平台的制备方法可用于GOx与不同疏水小分子药物的肿瘤共递送并实现安全有效的抗肿瘤治疗。 （2）肿瘤乏氧缓解和双重能量抑制型GOx基纳米药物用于肿瘤协同治疗 根据肿瘤内部乏氧和代谢重编程特征，本研究在GOxNPs的制备基础上，设计了一种负载寡霉素A（OA）并在最外层包覆细菌外膜囊泡（OMV）的GOx基纳米药物（OAGO）,通过抑制肿瘤氧化磷酸化（OXPHOS）、阻断糖酵解以及缓解肿瘤乏氧，从而实现肿瘤增强型饥饿、代谢和PTT的协同疗效。GOx作为一种酸触发降解和酶活性恢复的载体，实现了OA的肿瘤蓄积和可控释放。释放的GOx通过消耗大量的葡萄糖来抑制糖酵解。同时，OA通过抑制线粒体ATP合成酶降低了OXPHOS并减少肿瘤内O2的消耗，其改善了肿瘤内乏氧进一步促进了GOx的氧化催化反应。OAGO可以降低乏氧诱导因子（HIF-α）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，并诱导凋亡蛋白（Caspase-3）显著上调。最外层的OMV不仅提高了OAGO的肿瘤蓄积和肿瘤血氧饱和度以增强GOx催化功能，还引起肿瘤血管中红细胞外渗和凝血进一步用于PTT。因此，OAGO既通过OA诱导的OXPHOS抑制和GOx诱导的糖酵解阻断的双途径作用，最大程度地减少肿瘤细胞的能量供应，又通过OA引起的氧耗减少和OMV引起的血氧饱和度增加共同缓解了肿瘤乏氧，从而实现了肿瘤高效的饥饿、代谢和PTT协同疗效。 （3）可程序化释放和自我激活的GOx基纳米药物用于成像指导的抗肿瘤治疗 为实现GOx基纳米药物治疗的可视化以及打破肿瘤乏氧对GOx和光敏剂联用的局限，本研究开发了一种GOx基纳米药物（NTP@GOx），通过程序化释放和自我激活用于成像指导的肿瘤饥饿、化疗和Ⅰ型光动力（PDT）的协同疗法。首先以硫缩酮（TK）作为化学连接键合成了Ⅰ型光敏剂9-二乙基氨基苯并[a]吩噻嗪盐酸盐（ET-NBS）-PTX前药（NTP）,将NTP与GOx通过蛋白质自组装技术形成纳米药物后，NTP的水溶性和肿瘤蓄积能力明显改善。在酸性的TME中，NTP@GOx会解组装并释放出游离的GOx用于催化内源性葡萄糖生成H2O2,而生成的H2O2则会加速TK连接键的断裂并释放出ET-NBS以及PTX用于Ⅰ型PDT和化疗。NTP@GOx既打破了乏氧条件下光敏剂和GOx联用的局限，又最大程度地降低了其系统毒性和对正常组织细胞的光毒性。荧光成像（FLI）和光声成像（PAI）分别用于监测NTP@GOx的肿瘤蓄积程度以指导PDT的最佳时间和治疗过程中血氧饱和度变化，实现了其癌症可视化治疗。 综上所述，本研究首次从GOx自身作为载体出发，探索并构建了一种新型GOx基纳米平台，实现了GOx与疏水药物的高效共递送和酸性可控释放，并通过酶活性的智能调控显著提高GOx基纳米药物的生物安全性。该方法既降低了GOx的系统毒性以及提高了其生物利用度，又解决了传统的GOx运输载体的代谢负担问题。在此基础上，进一步制备出两种酸响应型GOx基纳米药物，分别用于缓解肿瘤乏氧以增强协同疗效和实现所设计的GOx基纳米药物肿瘤治疗的可视化。这些研究结果将为开发新型抗肿瘤酶纳米药物提供新的设计思路，具有潜在的应用前景。
NETL