摘要
作为最普遍的恶性肿瘤之一，结直肠癌在癌症死亡中占较大比例。根据最新的流行病学调查数据，其发病比例和死亡率均位于前列。在我国，结直肠癌同样属于高发恶性肿瘤，因此，结直肠癌仍是我国居民健康的重要威胁。 免疫系统参与肿瘤进展，除了细胞免疫，肿瘤生长最近被认为与体液免疫有关。B细胞在体液免疫中发挥关键作用，可以产生免疫球蛋白，呈递抗原，以及分泌促炎细胞因子。根据近年来的研究数据，B细胞也是肿瘤微环境中淋巴细胞浸润的一个重要组成部分，多种肿瘤形式，例如结直肠癌、肝癌和胰腺癌，都存在肿瘤中B淋巴细胞的广泛浸润。其中调节性B细胞是一种浸润实体瘤的B细胞，根据肿瘤微环境的不同具有不同的表型。在肿瘤免疫微环境中，PD-L1检查点是免疫抑制的关键调节因子，与结直肠癌不良预后相关。相比肿瘤细胞，由宿主免疫细胞衍生的PD-L1对抗肿瘤免疫的抑制作用更强。肿瘤免疫逃避的一个重要机制是B细胞上PD-L1的高表达。然而，这些PD-L1+的B细胞是如何获得其表型的仍有待研究。 长链非编码RNA参与B细胞激活，恶性B细胞增殖，细胞死亡逃避以及DNA损伤和抗体的类别转换。在肿瘤微环境中，IncRNA在外泌体中含量丰富。外泌体是由多种细胞形成的微小的细胞外囊泡，包含一系列可以被传递到目标细胞内的生物成分，如RNA、蛋白质、脂质和可溶性因子，并作为必要介质参与细胞间通信。其中长链非编码RNA作为外泌体中最丰富的内容物之一，已被证明可以通过外泌体来影响免疫细胞的表型和功能。然而，结直肠癌来源的外泌体非编码RNA是否能够通过驱动B细胞中免疫抑制分子PD-L1的表达进而影响肿瘤的发展，目前尚不清楚。明确肿瘤外泌体长链非编码RNA调控B细胞免疫抑制性的作用和机制，通过限制B细胞的免疫抑制功能，可能发现肠肿瘤治疗新策略。 基于以上研究背景，我们通过小鼠肿瘤模型分析了长链非编码RNA在肠癌组织局部B细胞中的动态变化，探讨了肿瘤微环境中的外泌体长链非编码RNA对于B细胞功能和肠癌进展的影响，并进一步通过体外诱导模型研究其中的调控机制。 第一部分HOTAIR与肠癌预后不良相关，在肠癌局部B细胞中上调表达 首先，为了探索肠癌发展过程中肠道局部B淋巴细胞内长链非编码种类和丰度的变化，我们首先通过氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和葡聚糖硫酸钠(Dextransodiumsulfate,DSS)建立了小鼠原位肠癌模型，选取了肿瘤形成前T1期小鼠和T3期荷瘤小鼠，并对肠组织消化获得的免疫细胞进行了转录组测序，发现荷瘤小鼠肠组织B细胞中存在多种差异表达的长链非编码RNA。在上调lncRNA中进行筛选，发现HOTAIR是一种重要的长链非编码RNA,其在现有的报道中与多种疾病相关，在癌症中普遍被认为具有促肿瘤作用。但在肠癌中对于B细胞的影响尚不清楚。 我们下载了TCGA数据库中225例结直肠癌患者的临床信息和HOTAIR表达情况，通过对比发现HOTAIR高表达与预后不良相关。这提示在肠癌人群，HOTAIR可能发挥促癌作用。接着为了进一步确定HOTAIR在肠癌B细胞中的表达情况，我们利用小鼠肠癌细胞系MC38建立了小鼠肠癌原位移植瘤模型，消化肠组织并分选B细胞发现荷瘤小鼠肠组织局部B细胞中的HOTAIR上调表达。结合前期研究结果证明肠癌B细胞增强免疫抑制功能，提示我们伴随肠癌进展，B细胞逐渐上调抑制性功能可能与HOTAIR上调具有某种关联。 进一步我们通过在B细胞中电转染敲低HOTAIR的siRNA,分析HOTAIR对B细胞抑制性分子PDL1的影响。结果显示，敲低HOTAIR会下调PDL1的蛋白水平，并且RNA水平也降低，而抑制性分子TGFβ1、IL10、LAG3的表达并没有显著降低，说明敲低B细胞HOTAIR可以在转录水平下调PDL1的表达。 通过肠癌进展期B细胞内的转录组测序结果以及体内对HOTAIR表达模式的验证和敲低HOTAIR对B细胞PDL1的影响，这一部分实验结果提示我们HOTAIR可能通过促进B细胞抑制性分子PDL1的表达来影响肠癌预后。 第二部分外泌体HOTAIR上调B细胞内PDL1表达，促进肠癌进展 肿瘤细胞自身在淋巴细胞浸润和功能控制中起着至关重要的作用。此外，最近发现肿瘤细胞可能利用外泌体将自身的基因组DNA、lncRNA、微小miRNA和其他分子转移到免疫细胞，导致免疫细胞重新编程。外泌体是多种细胞主动分泌的直径约为40-150nm的细胞外小泡，其内容物与分泌细胞类似。越来越多的研究表明，外泌体可以通过被受体细胞吞噬并传递其内容物来实现细胞与细胞间的通讯。肿瘤微环境中，外泌体含量丰富，以往研究显示，其具有促肿瘤作用。肿瘤细胞可以通过其分泌的外泌体影响周围组分，重塑利于肿瘤发展的肿瘤微环境，包括影响肿瘤细胞干性、侵袭、生长及肿瘤血管生成，也可以诱生免疫细胞抑制性，帮助肿瘤免疫逃逸。因此，第二部分，我们研究了HOTAIR是否可以经外泌体由肿瘤细胞传递至B细胞，调控B细胞内PDL1表达，促进肠癌进展。 我们首先利用超速离心法分离了小鼠肠癌细胞系MC38来源的外泌体，采用透射电镜和纳米粒子追踪技术对肿瘤细胞分泌的外泌体鉴定了其形态和大小。核糖核酸酶A(RNaseA)/TritonX-100(破坏囊泡脂质双层)消化实验结果显示，HOTAIR存在于囊泡内，受外泌体保护免受RNaseA消化。这提示我们肠癌来源的外泌体中存在HOTAIR。 接着，为了研究HOTAIR是否可以经外泌体由肿瘤细胞传递至B细胞，调控B细胞内PDL1表达，我们通过慢病毒构建HOTAIR敲减/过表达MC38细胞株，提取HOTAIR敲减/过表达外泌体与B细胞共培养发现相比于正常外泌体(exo-NC)共培养的B细胞，与敲减了HOTAIR的外泌体(exo-KD)共同培养的B细胞中HOTAIR和PDL1的表达下调，与过表达了HOTAIR的外泌体(exo-OE)共同培养的B细胞中HOTAIR和PDL1的表达上调。说明外泌体中的HOTAIR可以传递到B细胞中调控B细胞PDL1的表达。同时，为了证明外泌体HOTAIR影响B细胞的抑制性功能。将不同外泌体诱导过的B细胞与CD8+T细胞共孵育，发现富含HOTAIR的外泌体诱导过的B细胞与exo-NC-B相比可以抑制CD8+T增殖、抑制分泌γ干扰素，高表达耗竭相关分子PD1,说明exo-OE增强B细胞的抑制性功能:而exo-KD-B可以使CD8+T的以上指标具有相反的趋势，说明exo-KD削弱了B细胞的抑制性功能。为了研究外泌体HOTAIR极化的B细胞对T细胞的抑制作用是否依赖于PDL1/PD1信号，我们使用抗PDL1来阻断共培养系统中的PDL1/PD1信号。结果显示，exo-OE诱导的B细胞对CD8+T细胞的抑制作用在阻断PDL1/PD1信号后被削弱，显示PD1表达下降，TNFa和IFNγ的产生增加。这些结果表明，肠癌来源的外泌体HOTAIR可以促进PDL1+B细胞表达，并有助于抑制效应T细胞。因此，体外实验说明HOTAIR可以经外泌体传递至B细胞，上调PDL1表达，增强B细胞抑制性功能。 进一步，为了研究外泌体HOTAIR在肠癌进展中的生物学作用，首先利用MC38构建小鼠原位移植瘤模型，当肿瘤在6天形成时，将纯化的敲低/过表达HOTAIR的不同外泌体通过尾静脉注射到小鼠体内，以评估外泌体HOTAIR是否影响体内肿瘤的发生。结果显示与对照组相比,exo-KD显著降低了肿瘤重量，同时从肿瘤组织分离的B细胞中HOTAIR表达降低;而exo-OE促进肿瘤生长并且上调B细胞内HOTAIR。为了确定外泌体HOTAIR调节肠癌进展是否依赖于B细胞，我们利用抗CD20抗体清除体内B细胞。结果发现，在B细胞缺失后，exo-KD不能显著抑制肿瘤生长。这些结果揭示，外泌体HOTAIR上调B细胞内HOTAIR从而促进结肠癌的进展。同时，伴随B细胞内HOTAIR的增多，B细胞的抑制性分子PDL1上调，CD8+T的耗竭分子PD1的表达升高，抗肿瘤细胞因子γ干扰素分泌被抑制，而清除B细胞后，CD8+T的抗肿瘤免疫功能恢复。体内实验说明外泌体HOTAIR抑制B细胞依赖的抗肿瘤免疫。 为了确定我们研究结果的临床相关性，我们首先利用TCGA数据显示高水平的外泌体标记物和分泌相关基因集（CD63、CD81、CD9、TSG101、YTK6）与CRC患者的总生存率差显著相关，这表明CRC的进展与肿瘤外泌体有关。此外，我们从CRC患者的血浆样本中分离了外泌体，并探讨了其中的HOTAIR水平，发现与健康人群相比，肠癌病人外周血循环外泌体HOTAIR分泌增多，而且CRC患者循环外泌体中HOTAIR的水平与肿瘤浸润PDL1+B细胞的水平相关。流式分析肿瘤组织免疫变化发现，B细胞上PDL1的表达与CD8+T细胞的PD1表达正相关，与抗肿瘤因子IFNγ负相关。说明肠癌中PDL1+B与CD8+T细胞抗肿瘤活性相关。因此，第二部分结果说明外泌体HOTAIR促进肠癌生长，伴随PDL1+B细胞抑制性增强。 第三部分HOTAIR通过PKM2-STAT3分子途径上调PDL1表达 为了阐明HOTAIR在结直肠癌中的潜在分子机制，我们进行了CHIRP-MS（RNA纯化的染色质分离技术联合质谱分析）来筛选与HOTAIR相互作用的蛋白，并利用癌症基因组图谱（TCGA）分析在结直肠癌患者中这些蛋白与PDL1表达的相关性。其中PKM2与PDL1表达有较高的正相关性，而且有研究表明PKM2对于免疫细胞和癌症细胞中免疫检查点PDL1的表达是必需的。接着，我们利用westernblotting进一步证实了PKM2与HOTAIR的结合。并且，我们发现外泌体HOTAIR表达的改变极大地调节了B细胞PKM2的蛋白水平而RNA水平没有明显差异。由于80％的蛋白质水平改变与泛素蛋白酶体降解有关，因此，我们推测HOTAIR可能会通过影响蛋白降解影响PKM2蛋白的稳定性。考虑到这一点，我们用蛋白质合成抑制剂环己亚胺(CHX)处理外泌体共培养的B细胞，以评估HOTAIR对PKM2降解的影响。结果显示B细胞与exo-OE共培养时PKM2蛋白降解速度减慢，与exo-KD共培养时-蛋白降解速度增加;蛋白酶体抑制剂MG-132可以恢复被exo-KD下调的PKM2蛋白水平。此外，与对照组相比，exo-KD共培养的B细胞内PKM2泛素化水平上调,exo-OE共培养的B细胞内PKM2泛素化水平下调。这些结果表明HOTAIR通过泛素-蛋白酶体途径抑制PKM2降解。 接下来，我们检测了在B细胞中PKM2能否调控PDL1表达，观察到PKM2抑制剂PKM2-IN-1能够下调PDL1的蛋白和RNA表达。先前的研究表明,PKM2可以作为磷酸化酶增加转录因子的磷酸化从而诱导下游基因的表达。例如PKM2可以磷酸化STAT3,而STAT3已被证明是PDL1的转录因子，为了确定HOTAIR是否能通过PKM2激活STAT3信号，我们首先使用免疫共沉淀来证明PKM2能与B细胞中的STAT3结合。接下来，我们评估了不同HOTAIR和PKM2表达水平下B细胞中STAT3磷酸化的状态。Westernblot结果显示，与exo-NC相比，由exo-OE诱导的HOTAIR过表达增加了STAT3的磷酸化，exo-KD诱导的HOTAIR低表达下调了STAT3的磷酸化;而且，PKM2-IN-1可以下调STAT3的磷酸化，由exo-OE诱导的HOTAIR过表达增加了被PKM2-IN-1阻断的STAT3的磷酸化。这些数据表明HOTAIR通过PKM2-STAT3分子途径促进PDL1转录水平的上调。 同时，在结直肠癌病人中，流式分析肿瘤组织免疫变化发现，B细胞上PDL1的表达与PKM2表达正相关。此外，我们将B细胞分成两组，PD-L1+和PD-L1-,PD-L1+组与PD-L1-组相比，PKM2表达增加。
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