摘要
当归作为我国传统中药材，具有广泛的应用，其在心血管疾病、妇科炎症等综合征的治疗中具有显著作用。核受体作为重要靶点，参与生物体内调控发育、代谢、炎症、免疫等多种生理过程。孤儿核受体Nur77在细胞因子、信号刺激下参与调控炎症、自噬、凋亡等细胞生命活动。线粒体在细胞自噬、炎症中扮演重要角色，线粒体通过自噬的方式清除炎症过程中损伤的线粒体，从而减轻炎性疾病的症状。在外界刺激下，孤儿核受体Nur77可以出细胞核定位到线粒体上，与P62、TRAF2等蛋白结合，调节线粒体的活动，这也表明Nur77可能是一个潜在调节炎症的重要靶点。 本论文研究对传统中药材当归进行成分分离，筛选出具有靶向孤儿核受体Nur77发挥抗炎潜力的化合物。通过溶剂回流提取法、溶剂萃取法从当归根茎中提取和富集苯酞类化合物，并通过现代制备分离方法对其进行纯化，通过理化性质和波谱解析手段鉴定其具体结构。最终得到24个化合物。鉴定其结构为Z-藁本内酯(1)、3-butylidene-6α-hydroxy-7α-ethoxyphthalide(2)、阿魏酸(3)、Z-6-hydroxyl-7-methoxyligustilide(4)、丁基苯酞(5)、E-藁本内酯(6)、Z-6,8'',7.3''-diligustilide(7)、Angeolidemethylester(8)、丁烯基苯酞(9)、Dibutylphthalate(10)、TokinolideB(11)、Angeolide(12)、Senkyunolide(13)、TokinolideA(14)、Z,Z''-6''.6,7.3''a-diligustilide(15)、Z-6,7-epoxyligustilide(16)、(E)-ConiferylEthylEther(17)、Angeolidemethylester(18)、ChuanxiongnolideR1(19)、ChaxiongnolideG(20)、SenkyunolideO(21)、Riligustilide(22)、levistolideA(23)、Z，Z''-6,6''，7,3''a-diligustilide(24)。对分离所得化合物进行抗炎活性检测，主要包括对于LPS诱导RAW264.7细胞后产生的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的释放，和OX-LDL诱导RAW264.7细胞产生动脉粥样硬化泡沫细胞特征性病理细胞后产生的TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的释放情况以及细胞胆固醇含量检测，并探究苯酞类化合物对与自噬密切相关的NF-κB通路中相关蛋白、自噬标志物的影响。在细胞水平上通过免疫荧光染色、免疫共沉淀探究Nur77抗炎机制中相关蛋白表达，细胞内Nur77的定位机制。动物体内实验采用LPS/D-GaIN进行诱导急性肝炎模型，探究所筛选出的苯酞类化合物TokinolideB的体内抗炎效果。 综上所述，本研究通过筛选当归中的苯酞类化合物，发现TokinolideB能够靶向Nur77发挥抗炎作用。在细胞水平上，能显著降低LPS诱导的炎症模型中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1-β和NO的释放，并且TokinolideB能逆转TNF-α诱导的H460细胞IκBα的降解，通过影响NF-κB通路来介导炎症反应过程。TokinolideB通过促使Nur77出核与P62、TRAF2共定位于线粒体上，调控细胞自噬产生抗炎作用。动物体内实验表明TokinolideB比报道的Nur77的天然配体Celastrol具有毒性更低的优势，TokinolideB加药处理后肝脏、血清中ALT、AST指标得到抑制，且对于野生型炎症的抑制水平要高于Nur77基因敲除小鼠。对肝脏组织进行免疫印迹分析发现TokinolideB通过下调IkBα,诱导LC3的表达。小鼠肝脏组织的切片结果表明化合物TB可以诱导Nur77出核并定位与线粒体上，促进TRAF2的表达发挥其抗炎功能，并且促进P62与Nur77的相互作用发挥促进自噬的功能。以上实验研究为传统中药当归在抗炎方面的研究提供一定初步探究基础，具有重要意义。
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