摘要
目的:巨噬细胞作为机体固有免疫应答的组成成分，其吞噬功能在机体清除梅毒螺旋体中发挥重要作用。糖酵解是细胞糖代谢供能的关键通路，可调控免疫细胞激活及其功能转变。至今梅毒螺旋体感染过程中糖酵解参与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体激活与巨噬细胞吞噬的作用尚不清楚。本研究拟分析梅毒螺旋体膜蛋白Tp47对巨噬细胞吞噬的影响，并探究糖酵解代谢通路和NLRP3炎症小体活化在巨噬细胞吞噬中的调控作用。 方法:（1）我们在巨噬细胞分别加入不同浓度（5、10、25、50μg/mL）Tp47刺激6h后，采用流式细胞术检测巨噬细胞吞噬荧光微球的能力;25μg/mL的Tp47与巨噬细胞分别作用0、1、3、6、12h,分析巨噬细胞吞噬荧光微球的能力随时间变化;（2）采用qPCR和westernblotting分别检测NLRP3炎症小体激活相关组分NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA和蛋白表达水平，同时用ELISA检测细胞培养上清中IL-1β的分泌水平，验证Tp47激活巨噬细胞NLRP3炎症小体;（3）分别采用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950预处理巨噬细胞和转染si-NLRP3抑制NLRP3炎症小体，检测Tp47刺激巨噬细胞吞噬荧光微球百分比，分析NLRP3炎症小体激活对Tp47诱导巨噬细胞吞噬的影响;（4）通过糖酵解压力测试检测细胞外酸化率（ECAR）以及收集细胞培养上清检测细胞代谢产物柠檬酸盐、磷酸烯醇式丙酮酸盐和乳酸水平，分析Tp47刺激巨噬细胞后糖酵解水平变化情况，进而采用糖酵解抑制剂2-脱氧-D葡萄糖（2-DG）预处理巨噬细胞，分析Tp47刺激细胞后NLRP3炎症小体激活情况，明确糖酵解对Tp47调控巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的影响;（5）采用Westernblotting检测糖酵解酶M2型丙酮酸激酶（PKM2）在Tp47刺激下蛋白表达水平变化情况，进而分别通过抑制剂shikonin和转染si-PKM2抑制PKM2,检测巨噬细胞糖酵解水平和NLRP3炎症小体相关蛋白表达情况，明确PKM2对巨噬细胞糖酵解和NLRP3炎症小体的影响。 结果:（1）不同浓度Tp47刺激巨噬细胞，巨噬细胞吞噬荧光微球的百分比呈现浓度依赖性（P＜0.001）;25μg/mLTp47刺激后巨噬细胞吞噬荧光微球的百分比随时间持续增加（P＜0.001）。（2）Tp47刺激巨噬细胞促进NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA和蛋白表达，并诱导巨噬细胞分泌IL-1β。（3）NLRP3抑制剂MCC950或si-NLRP3显著抑制Tp47所促进巨噬细胞吞噬荧光微球的百分比(P＜0.001)。(4)Tp47增强巨噬细胞糖酵解水平和最大糖酵解能力，并促进巨噬细胞糖酵解代谢产物柠檬酸盐、磷酸烯醇式丙酮酸盐和乳酸的产生;糖酵解抑制剂2-DG显著抑制IL-1βmRNA表达(P＜0.001)，而对NLRP3和caspase-1mRNA表达水平无明显影响(P＞0.05);2-DG显著抑制Tp47诱导的NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达(P＜0.001)。(5)Tp47促进巨噬细胞PKM2蛋白表达(P＜0.05)，而己糖激酶1(HK1)和己糖激酶2(HK2)蛋白表达水平变化差异无统计学意义(P＞0.05);PKM2抑制剂shikonin下调Tp47所促进的巨噬细胞NLRP3、caspase-1和IL-1βmRNA表达(P＜0.05)和NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达水平(P＜0.001);同样的，si-PKM2显著抑制Tp47激活的巨噬细胞NLRP3炎症小体(P＜0.001)。 结论:研究证实梅毒螺旋体膜蛋白Tp47促进巨噬细胞吞噬功能增强，进一步研究发现Tp47通过PKM2促进糖酵解激活NLRP3炎症小体，从而促进巨噬细胞吞噬功能。本项研究从全新的角度诠释梅毒螺旋体感染对宿主巨噬细胞吞噬的影响，将有助于深入理解梅毒螺旋体的感染机制和宿主免疫机制。
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