摘要
硅藻是一类对全球初级生产力具有重要贡献的光合真核生物，约占20％。目前，对硅藻分子生物学的研究，主要依赖于两个模式硅藻——三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana）。然而，这两株硅藻的分布不广、丰度不高，不是生态学上的优势种类。为了更好地研究硅藻代谢特征，揭示优势类群在全球物质循环中的重要作用，需要发展新的具有生态优势的模式硅藻。角毛藻(Chaetoceros,中心硅藻)是海洋硅藻中丰度最高的类群，是水体碳固定的主要贡献者，同时在水产养殖上有着广泛应用。目前，对该类群的研究主要集中在生理生化方面，缺乏有效的遗传操作工具，限制了角毛藻的基础生物学研究及商业化应用。在本文中，以牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)为研究对象，开发了遗传转化体系和基因编辑技术，并通过建立的高效遗传转化技术及CRISPR/Cas9体系实现了对硝酸还原酶(NR)和脲酶基因(URE)的单和双敲除，初步阐述了牟氏角毛藻氮代谢特点，尤其揭示了NR对尿素利用的调控。主要研究结果如下: 1.基于10种抗生素对牟氏角毛藻生长的影响，获得了适用于该藻的筛选标记——诺尔丝菌素(Nor)、博来霉素(Zeo)和杀稻瘟菌素-S(Bla-S)。使用牟氏角毛藻的岩藻黄素-叶绿素a/c结合蛋白4基因启动子(Lhcf4p)和乙酰辅酶A乙酰转移酶基因启动子(ACATp)驱动相应的3个抗性基因(诺尔丝菌素乙酰转移酶基因nat、博来霉素抗性基因ble和杀稻瘟菌素-S脱氨酶基因bsr)的表达，构建了适用于牟氏角毛藻的表达质粒。确定了牟氏角毛藻最适的电场强度为250V/mm,利用电穿孔法把表达质粒导入藻细胞内，在含0.5％琼脂的抗性平板上筛选，4～7天即可肉眼观察到转化子。PCR扩增、Southernblot、Westernblot以及报告基因的检测验证了外源基因的成功插入与表达。使用三种抗性筛选的转化效率分别为每108个细胞产生2900(Bla-S)、1700(Zeo)和25(Nor)个转化子。 2.使用牟氏角毛藻U6启动子(U6p)、ACATp、Lhcf4p分别驱动sgRNA、抗性基因(ble或bsr)和Cas9基因的表达，构建了适用于牟氏角毛藻的CRISPR/Cas9载体。通过敲除NR和URE对CRISPR/Cas9技术在牟氏角毛藻中的可行性进行了验证。利用电穿孔法将CRISPR/Cas9载体导入藻细胞内，测序证明获得了靶位点突变的转化子。NR单敲除藻株不能在以硝酸盐为唯一氮源的培养基中生长，NR与URE的双敲除突变株不能在以硝酸盐或尿素为唯一氮源的培养基中生长。转化时，当同时引入一个供体DNA时，Cas9蛋白导致的DNA双链断裂可以通过同源重组介导的修复(HDR)进行修复，且利用位于细胞核基因组DNA上的目的基因启动子驱动经HDR插入的抗性基因的表达可以获得更高的HDR效率。CRISPR/Cas9介导的突变效率和HDR效率最高分别为86％和30％。 3.野生型牟氏角毛藻能利用铵盐、硝酸盐和尿素，并且生长速度相当。转录分析显示，在组合氮源的培养条件下，铵盐通过抑制NR和URE的表达进而抑制藻细胞对尿素和硝酸盐的吸收与利用;尿素通过抑制NR的表达影响硝酸盐的利用;硝酸盐不影响URE的表达，但通过抑制高亲和尿素转运蛋白基因(UT)的表达进而轻微抑制对尿素的吸收。在NR突变株中，硝酸盐与尿素组合氮源培养时，硝酸盐完全不吸收，且尿素的吸收变慢，同时细胞的生长与野生型相比显著变慢。在NR突变株中回补NR基因以恢复其功能，NR回补藻株恢复了对尿素的快速吸收及生长速度，证实了NR突变对尿素利用的影响。 4.基于转录组及基因组数据，牟氏角毛藻存在定位于叶绿体和线粒体的GS/GOGAT。尿素由位于细胞质的URE水解成NH4+后可能主要进入叶绿体GS/GOGAT进行同化。通常细胞对硝酸盐的同化也在叶绿体中进行。转录组分析显示硝酸盐同化途径基因在以尿素为唯一氮源培养的NR突变株细胞中持续高表达，光合作用-天线蛋白则下调表达，暗示藻细胞处于一种持续的氮限制状态，并使得细胞对氮的利用受限。在NR突变株中过量表达UT，未能恢复细胞对尿素的吸收速度，说明NR突变导致的对尿素吸收的影响受胞内其它信号的调控，这一信号可能是以NR为核心蛋白的调控信号。
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