摘要
目的：帕金森病（Parkinson''sdisease，PD）是仅次阿尔茨海默症之后的第二大常见的神经退行性疾病。PD主要病理特征包括，大脑黑质致密部多巴胺神经元进行性丢失，α-突触核蛋白（α-synuclein）在神经元内异常聚集和路易小体形成。脑内ABCA1表达丰富，参与脑内胆固醇的转运。本文拟通过体外实验，研究ABCA1在α-突触核蛋白诱导的神经毒性中的作用及其可能机制。 方法：采用SH-SY5Y细胞、稳定表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞，分为对照组、sh-ABCA1组、sh-ABCA1+rapamycin组、rapamycin组；对照组、α-synuclein组、α-synuclein+sh-ABCA1组、α-synuclein+sh-ABCA1+rapamycin组进行实验。细胞转染sh-ABCA1沉默质粒，或给予rapamycin（200nM）处理，通过定量RT-PCR检测溶酶体水解酶基因（GCase、CTSD）的表达、凋亡相关基因（Bax、Bcl-2）；Westernblotting检测LC3II/I、p62、Beclin-1、α-synuclein、Bax、Bcl-2的蛋白表达；免疫荧光检测溶酶体胆固醇、TFEB核转位、LC3自噬体数量；mCherry-EGFP-LC3质粒与sh-ABCA1共转染细胞，并采用激光共聚焦检测细胞的自噬通量；流式细胞术检测细胞的凋亡水平；透射电子显微镜检测细胞自噬体形成。 结果：正常神经细胞中，与对照组相比，sh-ABCA1组溶酶体胆固醇明显增加，LC3II/I蛋白比值减少，p62蛋白水平增加，Beclin-1蛋白水平减少，LC3自噬体减少。与sh-ABCA1组相比，sh-ABCA1+rapamycin组LC3II/I蛋白比值增加，p62蛋白水平减少，Beclin-1蛋白水平增加，LC3自噬体增加。mCherry-EGFP-LC3自噬双荧光激光共聚焦结果显示，与对照组相比，sh-ABCA1组自噬通量受阻，但可被rapamycin逆转。 在稳定表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞中，与对照组相比，sh-ABCA1转染导致LC3II/I蛋白比值减少，α-synuclein蛋白水平增加，Beclin-1蛋白水平减少。LC3免疫荧光结果显示，与对照组相比，稳定表达α-synuclein使得LC3自噬体明显减少，而沉默ABCA1，LC3自噬体进一步减少。 正常神经细胞中，与对照组相比，sh-ABCA1组的GCase、CTSD的mRNA表达分别减少51.8%（Plt;0.01）、40.2%（Plt;0.001）。与对照组相比，sh-ABCA1组TFEB核转位减少，而rapamycin促进TFEB核转位。在稳定表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞中，与对照组相比，α-synuclein组的GCase、CTSD的mRNA表达分别减少48.4%（Plt;0.001）、28.7%（Plt;0.01）。与α-synuclein组相比，α-synuclein+sh-ABCA1组的GCase、CTSD的mRNA表达分别减少45.4%（Plt;0.01）、46.6%（Plt;0.01）。 正常神经细胞中，与对照组相比，sh-ABCA1组Bcl-2的mRNA表达减少77.3%（Plt;0.001），Bax的mRNA表达增加125.2%（Plt;0.001）。与sh-ABCA1组相比，sh-ABCA1+rapamycin组Bcl-2的mRNA表达增加156.9%（Plt;0.001），Bax的mRNA表达减少58.2%（Plt;0.001）。 在稳定表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞中，与对照组相比，α-synuclein组Bcl-2的mRNA表达减少34.5%（Plt;0.001），且蛋白水平减少，Bax的mRNA表达增加76.1%（Plt;0.001），且蛋白水平增加；与α-synuclein组相比，α-synuclein+sh-ABCA1组Bcl-2的mRNA表达减少62.9%（Plt;0.001），Bax的mRNA表达增加60.9%（Plt;0.001）。 在正常神经细胞中，与对照组相比，sh-ABCA1组细胞凋亡率增加；与sh-ABCA1组相比，sh-ABCA1+rapamycin组细胞凋亡率减少。在稳定表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞中，与对照组相比，α-synuclein组细胞凋亡率增加；与α-synuclein组相比，沉默ABCA1细胞凋亡率进一步增加。 结论：ABCA1敲低可致溶酶体胆固醇增加，损害溶酶体功能，引发溶酶体依赖途径的自噬受阻，而细胞凋亡则明显增加。细胞内高水平α-synuclein可明显影响溶酶体功能，抑制自噬，增加细胞凋亡发生率。在稳定表达α-synuclein的细胞系中，沉默ABCA1将进一步抑制自噬，引发α-synuclein清除障碍，增加细胞的凋亡率。结果提示，脑ABCA1可能参与PD的病理生理学机制，是影响溶酶体清除α-synuclein的重要分子之一。
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