摘要
虾青素、叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素是四种常见的类胡萝卜素，由于它们独特的生理功能，使它们在食品、饲料、保健品和化妆品领域被广泛应用。佐夫色绿藻(Chromochloriszofingiensis)是一种单细胞淡水绿藻，在异养条件下能积累较高的生物量，因此C.zofingiensis可用于规模化培养并作为生产这四种类胡萝卜素的工程藻株。由于异养条件下C.zofingiensis细胞中虾青素、叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素的含量较低，是其产业化面临的主要挑战。 为了提高异养培养时C.zofingiensis细胞内类胡萝卜素的含量，本文研究了异养条件下6种植物激素对C.zofingiensis生长和虾青素积累的影响，采用多条件协同诱导的方式使C.zofingiensis的生物量和虾青素含量得到显著增加。为了揭示异养条件下三因子诱导对C.zofingiensis虾青素合成的代谢调控机制，本研究利用了代谢组学的技术对三因子诱导过程中代谢物的变化进行分析，进而研究了可能影响虾青素合成的碳骨架物质的作用。对C.zofingiensis进行化学诱变得到一株能同时生产叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素的优势藻株，并对其高密度异养工艺进行研究。研究异养条件下白光、蓝光和黄绿光对C.zofingiensis突变体CZ-LZM3生长和色素合成的影响，利用代谢组学的方法解析了异养条件下白光、蓝光和黄绿光对C.zofingiensis突变体CZ-LZM3中三种类胡萝卜素合成的代谢调控机制，以及测定色素合成过程中关键基因的表达对结果进行验证。本研究的主要结果如下: (1)测定异养条件下6种植物激素对C.zofingiensis生长和虾青素积累的影响，发现赤霉素3(GA3)对佐夫色绿藻的诱导效果最好，虾青素含量比对照组高50.7％。研究了GA3联合高碳氮比和盐浓度对C.zofingiensis生长和虾青素积累的影响，通过方差和极差分析，发现当GA3的浓度为10mg/L,碳氮比为180∶1和盐浓度为200mM(三因子)时，对C.zofingiensis细胞生长的促进效果最好。将此最佳组合在7.5L发酵罐中验证，发现在第15天，C.zofingiensis的生物量可达235g/L,虾青素含量占干重的0.144％,虾青素产量为0.32g/L。 (2)利用广泛靶向代谢组学技术对异养条件下三因子诱导与C.zofingiensis虾青素合成相关的代谢特征进行研究。共检测到497个代谢物，其中有27种差异代谢物，涉及到糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、氨基酸代谢、虾青素合成和脂肪酸代谢途径。异养条件下三因子诱导激活了糖酵解、磷酸戊糖和三羧酸循环途径，这些途径的激活可为虾青素和脂肪酸的合成提供前体物质(3-磷酸甘油醛和丙酮酸)和还原力。脂肪酸的增加又能促进C.zofingiensis中虾青素酯的增加，从而起到积累虾青素的目的。基于差异代谢物分析的结果，选取了部分碳骨架代谢物来研究它们对虾青素合成的影响。通过添加外源化合物，发现甘氨酸和γ-氨基丁酸在不影响C.zofingiensis生长的同时还能促进虾青素的积累。苹果酸和柠檬酸也能促进C.zofingiensis虾青素的积累，但对细胞生长存在抑制作用。 (3)通过化学诱变的方式得到一株能同时积累叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素的突变体。经检测发现该突变体的BKT1基因上插入了9个碱基，导致虾青素合成障碍，从而积累叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素。对C.zofingiensis突变体CZ-LZM3的高密度培养工艺进行研究，发现该突变体保留了野生型能高密度异养的特性，在两阶段培养的策略下，培养至第16天C.zofingiensis突变体CZ-LZM3的生物量可达237g/L,三种色素产量之和可达1.7g/L。 (4)蓝光有利于三种类胡萝卜素的同时积累，白光有利于叶黄素的积累。运用广泛靶向代谢组学的方法揭示了白光、蓝光和黄绿光对异养条件下C.zofingiensis突变体CZ-LZM3合成三种类胡萝卜素的代谢调控机制。C.zofingiensis突变体CZ-LZM3磷酸戊糖途径、糖酵解和三羧酸循环的增强，可为色素合成提供前体物质和还原力。与对照组相比，八氢番茄红素合成酶(PSY)和β-胡萝卜素羟化酶（CHYb）的相对表达量在白光、蓝光和黄绿光下均增加。番茄红素β-环化酶(LCYb)在蓝光下的相对表达量显著高于白光和黄绿光;番茄红素ε-环化酶(LCYe)在白光下的相对表达量显著高于蓝光和黄绿光。基因表达的结果说明蓝光促进三种类胡萝卜素的积累，白光促进叶黄素的积累，可对代谢组学的结果进行验证。 本论文系统的运用代谢组学研究了异养条件下C.zofingiensis合成类胡萝卜素的调控机制，获得了新的藻种资源，扩展了C.zofingiensis的应用范围，利用C.zofingiensis规模化生产高附加值类胡萝卜素的产业化奠定理论基础。
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