摘要
不孕不育是一个全球性的健康问题，15％的育龄夫妇患有不孕症。辅助生殖技术(AssistedReproductiveTechnology,ART)作为治疗不孕不育的手段，其成功的一个关键因素是精子质量。目前临床上ART的精子筛选通常以密度或活力为标准进行质量评估，绕过了精子在女性生殖道复杂环境(如几何、流变和化学条件)中的自然筛选过程，导致成功率低、出生缺陷等风险。因此，本论文以微流控技术为工具，设计并制备了仿生芯片重构女性生殖系统微环境，研究精子在仿生系统中的行为，为建立科学的精子质量评价体系提供理论基础。 宫颈粘液作为精子进入生殖系统的第一道屏障，是影响精子在体内迁移和受精的重要因素。但由于其成分和流体性质复杂，对这种微环境的研究极少。我们使用宫颈粘液的替代物透明质酸模拟宫颈微环境，通过毛细作用在微流控芯片中形成透明质酸-培养液的液液界面。在构建的宫颈芯片中，精子能够在宫颈微环境和培养液两种液体环境之间的界面处自由迁移，我们首次实现了精子穿入穿出宫颈微环境的实时成像。通过对不同精子样本进行大批量的处理与分析，我们发现与穿入宫颈微环境的精子相比，穿出的精子表现出更高的运动速度。此发现揭示了宫颈微环境对精子在女性体内迁移的关键作用，为揭开精子如何通过第一道天然屏障(宫颈粘液)提供了强有力的理论基础。同时，该芯片能够简单，快速，高效地筛选出具备运动优势的高活力精子，这为建立科学的精子质量评价体系提供了理论基础和前提。 精子在穿过宫颈后经子宫直接前往输卵管。输卵管作为精卵受精的场所，决定精子能否与卵子相遇。在受精前，精子附着在输卵管上皮细胞表面，只有少部分精子能够逃离表面到达卵子附近。精子如何从输卵管表面脱离这一过程未被报道。我们使用纤连蛋白模拟输卵管上皮细胞，并设计微流控芯片构建了稳定的孕酮浓度梯度，以模拟输卵管微环境。在构建的输卵管芯片中，实时记录了精子在粘附表面的动态行为，发现了三种精子运动模式——锚定自旋、脱离-锚定自旋和逃离模式。为了揭示精子的逃离机制，我们通过理论计算提出了一种动力学模型，验证了粘附精子头部的旋转动能决定了其能否从表面脱离，并证实了这种行为可通过改变孕酮浓度进行调节。通过提取输卵管上皮细胞进行体外培养，构建了由真实上皮层形成的输卵管微环境，证实了仿生芯片中的精子运动模式，阐明了精子在输卵管微环境中运动的普遍规律。该研究结果揭示了精子在受精前从上皮细胞表面逃离的复杂过程，为揭开精子如何通过输卵管微环境提供了强有力的理论基础。为优化体外受精(InVitroFertilization，IVF)和卵胞浆内精子注射(IntracytoplasmicSpermInjection，ICSI)提供了新的发展方向。 精子从输卵管粘附的上皮层脱离后前往卵子附近与之受精。受精过程中最重要且最复杂的是精卵融合，包括细胞极化、质膜重塑、受体信号传导等。精子作为具有高度能动性的融合细胞之一，如何与卵子发生融合还未见报道。我们通过对精卵融合的过程进行高速动态成像，首次发现了精卵融合的两种模式—卵子被动接受和主动吞噬。为提高成像的时空分辨率，开发了一种将精卵融合位点控制在极小范围内的微流控3D成像平台，能够对融合过程进行时空高分辨动态追踪。为进一步探索精卵融合过程中精子鞭毛摆动产生的机械力的作用，结合化学表面修饰技术、力学测量平台和高分辨成像平台，开发了高精度单细胞力学调控平台，对单个精卵实现精准操控，为研究机械力参与精卵融合方式奠定了基础。 综上，本研究开发了用于重构女性生殖系统微环境的仿生芯片及微流控3D成像平台，对精子从穿过宫颈第一道屏障，到达输卵管中挣脱粘附表面向卵子迁移、最终与卵子发生受精的行为进行了详细的研究。结合物理模型，阐明了精子在女性生殖系统中以明显的运动优势穿出宫颈微环境，以旋转动能优势从输卵管表面脱离，最后以两种模式与卵子发生融合的行为机制。为揭开精子如何通过宫颈、输卵管微环境提供了强有力的理论基础，为建立更科学完善的辅助生殖技术提供了新的方向。
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