摘要
第一部分多柔比星通过调节肿瘤微环境增强TNBC免疫检查点抑制剂的疗效 目的:验证多柔比星相比于其他化疗药物(顺铂和紫杉醇)显著提高免疫检查点抑制剂(PD-1抑制剂)对于三阴性乳腺癌(triple-negativebreastcancer，TNBC)的疗效。观察化学药物联合免疫检查点抑制剂治疗后小鼠肿瘤组织肿瘤微环境的改变情况。 方法:利用皮下成瘤技术，在月龄4～6周的BALB/c小鼠皮下接种鼠源的TNBC细胞4T1。4T1接种后的第5、8、11天对实验组小鼠注射多柔比星、顺铂和紫杉醇等化疗药物，对照组小鼠注射PBS;在第14、17、20天对实验组和对照组小鼠注射鼠源PD-1抗体。第5天起每隔2天进行皮下瘤体积测量，第23天时取皮下瘤称重。利用转录组测序技术(以下简称RNA-seq)对于小鼠肿瘤组织进行mRNA测序，并进行差异基因筛选，GO富集分析，以及KEGG通路富集分析等。利用ssGSEA进行肿瘤微环境的免疫细胞浸润分析，观察不同化疗药物对于肿瘤微环境的影响，确定变化最显著的免疫细胞组成成分。 结果:皮下成瘤实验表明，与对照组相比，多柔比星联合PD-1抑制剂治疗组的小鼠较其他化疗药物联合PD-1抑制剂治疗组，肿瘤体积减少最为显著(p＜0.05),第23天肿瘤重量更轻(p＜0.05)，且小鼠体重未见明显下降。GO和KEGG分析结果提示，多柔比星治疗组相较于其他化疗药物治疗组，其小鼠肿瘤微环境中炎症因子和炎症相关通路显著富集。ssGSEA免疫细胞浸润分析提示，多柔比星治疗后，小鼠肿瘤组织中的免疫微环境向“促炎”表型转变。多柔比星联合PD-1抑制剂治疗相较于其他化疗药物联合PD-1抑制剂治疗显著提高肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润程度(p＜0.01)。 结论:多柔比星对PD-1抑制剂治疗TNBC的增敏效果显著高于其他化疗药物。多柔比星相比其他化疗药物更能诱导小鼠肿瘤组织转变成利于PD-1抑制剂治疗的“促炎”肿瘤微环境，更为显著地提高肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润程度。 第二部分多柔比星通过提高CD8+T细胞浸润促进TNBC的免疫检查点抑制剂疗效 目的:利用动物肿瘤组织的流式细胞术和免疫组织化学染色等方法，观察不同化疗药物处理后肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润程度，以及活化性和耗竭性CD8+T细胞占比情况。验证多柔比星相比于其他晚期乳腺癌常用化疗药物(顺铂和紫杉醇)更能提高肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润程度。 方法:采用肿瘤组织流式细胞术和免疫组织化学染色等方法，检测小鼠接受不同化疗药物治疗第14天时肿瘤组织中CD8+T细胞的比例。利用RNA-seq数据绘制热图，观察使用不同化疗药物，联合PD-1抑制剂治疗前后小鼠肿瘤组织中活化性和耗竭性CD8+T细胞标志性基因的表达水平。利用流式抗体混合染色(包括IFNγ、GranzymeB和PD-1)，观察不同化疗药物治疗后活化性和耗竭性CD8+T细胞在小鼠肿瘤组织中的比例。利用肿瘤组织流式和免疫组化等方法，观察使用不同化疗药物后联合PD-1抑制剂治疗后第23天时小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润情况，以及肿瘤组织中活化性和耗竭性CD8+T细胞的占比情况。 结果:流式细胞术和免疫组织化学染色发现与其他化疗药物相比，多柔比星治疗组的小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的占比显著增高(p＜0.01)。热图提示，多柔比星治疗的小鼠肿瘤组织相较于顺铂、紫杉醇以及对照组，表达更高水平的活化性CD8+T细胞标志性基因(IFNγ、GranzymeB)(p＜0.01),而耗竭性CD8+T细胞基因表达水平在各组间无显著差异。流式细胞术发现与其他化疗药物相比，IFNγ和GranzymeB阳性的CD8+T细胞较其他组占比更高(p＜0.05);PD-1阳性的CD8+T细胞在顺铂治疗组中占比更高(p＜0.05)。流式细胞术和免疫组织化学染色发现与其他化疗药物联合PD-1抑制剂相比，多柔比星联合PD-1抑制剂治疗组的小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的占比显著增高(p＜0.01)。流式细胞术结果提示，在所有化疗组联合PD-1抑制剂治疗后，活化性CD8+T细胞比例较未用免疫治疗前更高(p＜0.05),耗竭性CD8+T细胞显著降低(p＜0.001),肿瘤组织中免疫微环境由“抗炎”表型向“促炎”表型转变，以多柔比星联合免疫治疗的效果最好。 结论:体内实验证明，多柔比星相比于其他化疗药物(顺铂、紫杉醇)更能促进CD8+T细胞的浸润，其中具有杀伤肿瘤效应的活化性CD8+T细胞占比显著增高。多柔比星联合PD-1抑制剂后，肿瘤微环境具有更强的抗肿瘤效应。 第三部分多柔比星通过激活三阴性乳腺癌细胞STAT1-IRF1-CXCL10轴表达促进CD8+T细胞浸润 目的:体外细胞实验验证多柔比星相比于其他化疗药物(顺铂和紫杉醇)更能促进CD8+T细胞的迁移。利用流式细胞术等方法，检测不同药物处理后活化性和耗竭性CD8+T细胞占比情况。探索多柔比星促进CD8+T细胞浸润的分子机制。 方法:CCK-8测定TNBC细胞株MDA-MB-231、BT549和4T1在多柔比星、顺铂和紫杉醇药物作用48h下的“IC50”，为后续实验提供药物处理的参考。外周血分离单个核细胞后对CD8+T细胞进行磁珠分选，提取原代CD8+T细胞。利用8μm孔径的Transwell小室将CD8+T细胞和不同药物处理后的TNBC细胞上清共培养，利用流式细胞术检测从上室迁移到下室中的CD8+T细胞数量。利用0.4μm孔径的Transwell小室将CD8+T细胞与不同药物处理后的TNBC细胞共培养48h,利用流式细胞术检测上室中活化性和耗竭性CD8+T细胞的占比。根据体内实验中小鼠肿瘤组织RNA-seq数据，挑选出多柔比星治疗组中表达显著提高的基因和相关分子通路，观察与CD8+T细胞浸润相关的趋化因子的表达变化，进行相关体内、体外实验验证。TNBC细胞株MDA-MB-231、BT-549和4T1分别经DMSO和多柔比星、顺铂、紫杉醇处理后，利用PCR方法检测与CD8+T细胞相关的趋化因子在TNBC细胞中的表达情况。使用ELISA检测细胞上清液中CXCL10的蛋白含量和体内实验不同处理组小鼠肿瘤组织中CXCL10的蛋白含量。结合测序数据发现多柔比星治疗组中，STAT1-IRF1-CXCL10轴表达显著提高。PCR和WB法验证TNBC细胞株经过不同化疗药物处理后的STAT1和IRF1mRNA和蛋白表达水平变化。回复实验中，TNBC细胞株中STAT1基因敲低后，利用PCR、WB和ELISA等方法检测STAT1-IRF1-CXCL10轴的蛋白水平改变，利用Transwell实验检测STAT1基因敲低后CD8+T细胞迁移能力改变。利用敲低STAT1基因的4T1进行小鼠皮下成瘤实验，观察多柔比星联合PD-1抑制剂治疗组肿瘤体积及重量的改变并评定疗效，利用流式细胞术观察CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润水平。 结果:Transwell实验结果提示，体外培养的TNBC细胞接受多柔比星处理相较于接受顺铂、紫杉醇以及对照组DMSO处理更能促进CD8+T细胞的迁移(p＜0.05)。经过不同药物处理的TNBC细胞与CD8+T细胞共培养结果显示，与多柔比星处理后的肿瘤细胞共培养后CD8+T细胞中活化性的CD8+T细胞占比更高(p＜0.05),耗竭性CD8+T细胞的占比与其他实验组及对照组相比无明显变化。KEGG通路富集分析显示多柔比星处理后细胞因子和趋化因子相关通路显著激活，其中与CD8+T细胞浸润相关的CXCL10趋化因子表达显著提高(p＜0.01)。PCR实验证实，与其他化疗药物处理组和对照组相比，TNBC细胞株经多柔比星处理后CXCL10表达显著提高(p＜0.001),ELISA实验证明，TNBC细胞分泌在上清液中的CXCL10水平显著增多(p＜0.001);体内实验中，与其他化疗药物治疗组和对照组相比，ELISA检测证实多柔比星处理后肿瘤组织匀浆中，CXCL10水平显著增多(p＜0.0001)。利用测序数据绘制火山图，结果显示STAT1-IRF1-CXCL10轴在多柔比星处理组中表达水平显著提高。PCR和WB结果表明TNBC细胞株经多柔比星处理后，STAT1-IRF1-CXCL10轴表达显著高于其他实验组及对照组(p＜0.01)。回复实验证明，STAT1基因敲低的TNBC细胞系经多柔比星处理后，CXCL10分泌显著降低(p＜0.01),与其共培养的CD8+T细胞迁移能力减弱(p＜0.01);体内实验证明敲低STAT1基因的肿瘤对于多柔比星联合PD-1抑制剂治疗不敏感，治疗后肿瘤体积和重量较未敲低组显著增大(p＜0.01),流式细胞术检测结果显示肿瘤组织中CD8+T细胞浸润程度显著降低(p＜0.001)。 结论:体外实验证明，多柔比星相比于其他化疗药物(顺铂、紫杉醇)更能促进CD8+T细胞向肿瘤迁移，其中具有杀伤肿瘤效应的活化性CD8+T细胞占比更高。多柔比星通过激活三阴性乳腺癌细胞STAT1-IRF1-CXCL10轴增加CD8+T细胞浸润进而促进免疫检查点抑制剂的疗效。
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