摘要
研究背景 原发性肝癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）是最常见的恶性肿瘤之一,肝癌复发与转移仍然是制约肝癌患者长期生存的关键因素，阐明肝癌转移机制、寻找新治疗靶点仍具有十分重要的现实意义。铁死亡（ferroptosis）是近年来新发现的一种死亡方式，有关该死亡方式是否参与肝癌转移的调控，能否作为抗肝癌转移治疗靶点以及相关分子机制仍知之甚少。我们前期研究发现miR-612能够负性调控HADHA，抑制胆固醇的合成，在此基础上我们研究了miR-612对铁死亡的调控作用及其机制，探索其在肝癌转移过程中的影响，以期为肝癌的治疗提供新的策略。 研究目的 本课题拟从细胞生死命运调控的角度出发，着重探讨miR-612对肝癌细胞铁死亡和肝癌转移的调节作用及其分子机制，以期阐明miR-612对肝癌细胞MVA代谢途径、CoQ10生物合成、SLC7A11等分子表达、定位和功能以及铁死亡发生对肝癌转移的影响。明确miR-612和铁死亡对肝癌生长与转移的临床意义，为探索肝癌临床治疗新策略奠定理论基础。 方法和结果 1.miR-612对肝癌细胞铁死亡的调控作用 运用CCK8实验检测不同肝癌细胞经铁死亡诱导剂RSL3诱导后的细胞活性，发现低转移潜能的肝癌细胞对铁死亡更敏感;流式检测RSL3诱导前后细胞内lipid-ROS的表达情况，发现RSL3诱导前高转移潜能的肝癌细胞中lipid-ROS表达明显低于低转移潜能的细胞，说明高转移潜能细胞本身具有更强的抗氧化系统，对ROS的耐受性强，提示铁死亡与肝癌的转移密切相关。进一步通过普通光学显微镜、电镜观察肝癌细胞发生铁死亡过程中的形态学和内部结构变化，通过高内涵显微镜观察其亚铁离子和ROS变化。 前期研究发现miR-612与肝癌转移潜能呈负相关，我们构建了miR-612过表达和敲除的稳转细胞株，利用CCK8实验检测上述细胞经RSL3诱导后的细胞活性变化，发现miR-612过表达后细胞对铁死亡的敏感性增强，而miR-612敲除后细胞对铁死亡抵抗，流式检测发现miR-612可以促进肝癌细胞的lipid-ROS的表达进而促进铁死亡。克隆形成实验、细胞迁移侵袭实验进一步证实miR-612通过促进铁死亡影响肝癌的增殖与转移。 2.miR-612通过HADHA介导的MVA通路调控肝癌细胞的铁死亡 前期研究发现miR-612通过抑制HADHA减少细胞内胆固醇的合成，在本部分中构建HADHA过表达和敲低的稳转细胞株，利用CCK8实验检测上述细胞经RSL3诱导后的细胞活性变化，发现HADHA过表达后细胞对铁死亡的抵抗性增强，而HADHA敲低后细胞对铁死亡更敏感，进一步通过补救实验证明miR-612通过调控HADHA影响肝癌细胞铁死亡。 Westernblot实验显示HADHA可促进MVA代谢通路关键酶的表达，从而开放MVA通路，质谱分析结果显示HADHA过表达后促进MVA下游产物CoQ10的合成。CoQ10是铁死亡的关键抑制因子，因此miR-612可通过抑制HADHA,抑制MVA通路而减少CoQ10的表达从而促进铁死亡的发生。我们进一步通过质谱分析发现细胞HADHA过表达可增加细胞内PUFAs和氧化脂质的代谢，从而促进铁死亡的发生。动物实验证实miR-612可通过促进肝癌细胞铁死亡抑制肿瘤的增殖。 3.SLC7A11介导MVA通路调控肝癌细胞铁死亡的机制初探 SLC7A11是铁死亡的关键分子，我们通过APEX2末端标记技术和质谱分析技术探究了与SLC7A11相互作用的蛋白，通过免疫荧光共定位和CoIP实验验证TFRC可与SLC7A11结合。通过比较RSL3诱导前后与SLC7A11结合的差异蛋白，共发现176个差异蛋白，并对这些蛋白进行了亚细胞定位分析、蛋白互作分析和GO、KEGG通路分析，发现MVA途径可能通过FPP、GGPP对Ras超家族蛋白的异戊二烯化修饰参与调控SLC7A11，进而影响铁死亡。 通过肝癌数据库分析发现SLC7A11是影响肝癌预后的重要分子，SLC7A11在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织，并与肝癌预后呈负相关。进一步通过85对肝癌和癌旁组织的组织芯片进行免疫组化分析，结果显示SLC7A11的表达与肿瘤大小、肿瘤分化程度、BCLC分期有关，与患者年龄、性别、HBsAg、肿瘤数目、是否有脉管侵犯无关。SLC7A11的表达水平是影响肝癌患者总生存期及无瘤生存期的重要预后因素。 结论 1.miR-612可促进肝癌细胞的铁死亡，影响肝癌的增殖与转移。 2.miR-612通过靶向HADHA抑制MVA代谢通路，减少细胞内CoQ10的形成，增加细胞内PUFA和氧化脂质的含量，从而促进铁死亡的发生。 3.MVA途径可能通过FPP、GGPP对Ras超家族蛋白的异戊二烯化修饰参与调控SLC7A11,进而影响铁死亡。 4.SLC7A11是肝癌预后不良的重要标志。 创新点 1.明确了miR-612对肝癌细胞铁死亡的调控作用，为降低肝癌的复发转移鉴定理论基础。 2.利用APEX2末端标记联合免疫沉淀质谱分析发现SLC7A11新的结合蛋白。3.首次阐述MVA途径对SLC7A11的调控作用，为阐明铁死亡新的机制提供思路。
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