摘要
胆道闭锁(biliaryatresia,BA)肝脏纤维化的机制目前尚不明确。长链非编码核糖核酸(longnon-codingRNAs,LncRNAs)是一类RNAs，不编码蛋白质，长度＞200nt，广泛存在于自然界各种生物如动植物、真菌以及病毒中。虽然LncRNAs没有编码蛋白质的能力，但能够作为海绵分子吸附结合一些特定的微核糖核苷酸(microRNAs，miRNAs)，进而影响该miRNAs结合的靶基因的表达，从而发挥作用。本研究首先借助Agigent人类LncRNAs表达谱芯片对BA患儿外周血血浆外泌体进行研究，筛选差异表达的LncRNAs;随后，将目标LncRNAs在BA肝脏组织中进行验证，并对其进行细胞定位;最终，在定位细胞中过表达目标LncRNA,细胞实验结合生信分析找出和BA纤维化相关的靶基因。本研究旨在筛选BA纤维化相关的LncRNAs,并对及其发挥作用的可能机制进行初步探索。 第一部分胆道闭锁患儿血浆外泌体LncSOS1-IT1表达谱 目的:研究BA患儿血浆外泌体中LncRNAs表达谱，筛选和胆道闭锁纤维化相关LncRNAs，并进行生信分析，探索其可能调控的miRNAs以及潜在的靶基因。 方法:通过使用AgilentHumanLncRNAs表达谱芯片，在BA、非BA胆汁淤积(cholestasis,CH)及正常对照组(NOR)血浆外泌体进行芯片杂交，筛选出差异表达的LncRNAs,并进行生物信息学分析，筛选目标LncRNAs;进一步通过靶基因预测软件寻找其潜在调控的miRNAs以及发挥作用相关通路分析。 结果:通过外周血血浆外泌体LncRNAs表达谱芯片检测分析，共筛选出差异基因29个，其中27个上调，2个下调。利用StarBase数据库进行靶基因预测发现,其中上调的LncSOS1-IT1和miR124-3p靶向结合，上调该miRNA的靶基因主要影响FoxO、细胞衰老、神经营养因子、乙型肝炎、巨细胞病毒感染以及肌动蛋白细胞骨架调节等信号通路。 结论:BA患儿血浆外泌体中多种LncRNAs存在差异表达，经过生信分析及文献查阅，发现其中高表达的LncSOS1-IT1可能和BA胆管增生及肝纤维化相关。 第二部分胆道闭锁LncSOS1-IT1水平与肝脏组织纤维化 目的:研究LncSOS1-IT1在BA肝脏组织中的表达水平，验证其和肝纤维化程度的关系并对其在组织中进行细胞定位。 方法:利用qRT-PCR检测LncSOS1-IT1在BA及CH肝脏组织中的相对表达水平，并确定其和病理纤维化分级的关系(改良Scheuer评分标准)。进一步在组织中通过荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization,FISH)对LncSOS1-IT1进行细胞定位。 结果: 1.LncSOS1-IT1在胆道闭锁患儿肝脏组织中高表达(BAvsCH:2.98±2.723vs.1.561±1.736,P=0.012)。 2.病理肝纤维化分级更高的患儿中LncSOS1-IT1表达量也更高(F3-4vs.F1-2:2.795±2.535vs.1.098±0.6094,P=0.008)。 3.FISH实验在肝门区纤维块中研究发现，LncSOS1-IT1在胆管上皮细胞中表达量高，在成纤维细胞或星状细胞中也有表达。 结论:LncSOS1-IT1在BA肝脏组织中高表达，和BA肝纤维化程度可能相关,在组织中进行细胞定位发现其主要定位在BA病变的胆管上皮细胞上。 第三部分LncSOS1-IT1在胆管上皮细胞中促进肝纤维化机制的初步探索 目的:探索LncSOS1-IT1在胆管上皮细胞中高表达后促进BA肝纤维化的可能机制。 方法:通过细胞转染构建过表达LncSOS1-IT1的人胆管上皮细胞株，对转染成功的细胞进行LncSOS1-IT1的胞内定位，并进行RNA测序，测序结果结合公共数据库进行生信分析，推测LncSOS1-IT1发挥作用可能机制。 结果: 1.成功构建病毒稳定转染胆管上皮细胞株，细胞FISH实验发现LncSOS1-IT1主要存在于胆管上皮细胞的胞质中。 2.过表达LncSOS1-IT1(overexpression,OE)和空白对照的胆管上皮细胞(CON)进行基因测序。利用GSEA数据库富集分析测序结果发现LncSOS1-IT1可能和KRAS信号、MTORC1信号、IFN-γ反应及TGF-β信号通路等相关。 3.细胞测序获得的结果结合GEO数据库中的肝组织芯片数据(GSE46960及GSE15235)分析出可能和LncSOS1-IT1有关的胆道闭锁纤维化相关基因集，共6个基因，分别为:PECAM1、PRR16、NPNT、OLFML3、THBS2、SPINK1。其中PECAM1、NPNT和THBS2的在BA肝脏组织的显著高表达且和纤维化相关性高，且和肝纤维化相关分子COL3A1、COL4A1及HAS2显著相关。 结论:LncSOS1-IT1和BA肝纤维化程度相关，可能通过以下3个分子PECAM1、NPNT和THBS2发挥作用。
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