摘要
1背景 哮喘是一个世界范围内亟待解决的公共卫生问题，长期受到临床和基础研究领域的关注，其核心病理生理特征是气道炎症，伴随结构性改变，共同导致气道高反应性。随着分子生物学的进步，表观遗传学机制尤其是RNA的m6A甲基化修饰在各种生理功能和病理活动等生物学过程中的功能和机制逐渐被揭示，目前其已被证实在多种疾病的炎症性病理变化中起关键作用。木犀草素对炎症性疾病的干预效应目前已得到确认，前期研究也证实了该药具有较好的抗哮喘气道炎症作用。基于此，本研究提出科学问题:m6A修饰是否也在哮喘气道炎症病理方面发挥作用？木犀草素是否参与了该过程的调控？本论文围绕这些问题展开研究。 2目的 本研究旨在探讨m6A修饰在哮喘气道炎症中的作用机制及木犀草素在其中的干预效应，以深化对哮喘与m6A修饰相互关系的理解，评估m6A表观遗传修饰在哮喘治疗中药开发中的潜力。 3方法与结果 3.1文献回顾 3.1.1方法 通过使用“哮喘”“asthma”“N6-甲基腺苷”“m6A”“治疗”“therapy”“机制”“mechanism”等相关主题词，对知网、百度学术、PubMed、WebofScience等数据库进行检索，梳理相关文献。概述哮喘、m6A修饰及m6A修饰在疾病机制中的应用等相关研究进展，总结m6A修饰对哮喘研究的影响和启示。 3.1.2结果 综合分析相关前沿研究发现，m6A修饰在多种疾病的炎症性病理过程中发挥促进或抑制的作用，并且m6A修饰可能通过调控关键基因的表达而影响哮喘的病理变化，其在哮喘治疗研究中具有应用潜力。 3.2哮喘小鼠的m6A修饰特征分析 3.2.1方法 通过鸡卵清蛋白（OVA）致敏与激发建立哮喘小鼠模型;使用BuxcoRC系统检测小鼠肺功能;使用血气分析仪对小鼠肺泡灌洗液（BALF）细胞沉淀进行白细胞分类计数;使用ELISA法检测小鼠BALF上清液中IL-4、IL-5、IL-13及血清中IgE的水平;HE染色观察小鼠肺组织的炎症细胞浸润情况;PAS染色观察小鼠气道中杯状细胞增生及黏液分泌情况;MASSON染色观察小鼠气道结构变化情况;利用比色法检测肺组织总RNA的m6A修饰水平;利用MeRIP-seq联合RNA-seq技术检测小鼠肺组织的m6A修饰变化且表达变化的基因。 3.2.2结果 与空白对照小鼠相比，哮喘小鼠气道阻力显著增加，肺动态顺应性显著降低;BAFL沉淀中总白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等的数量明显增加;血清中的IgE及BALF中的IL-4、IL-5、IL-13的浓度显著升高;气道和血管周围炎性细胞的浸润、气道黏液分泌及杯状细胞增生程度显著增加，及气道结构有改变趋势;肺组织中总RNA的m6A修饰水平显著升高。MeRIP-seq与RNA-seq结果显示，哮喘小鼠肺组织中有329个m6A甲基化水平升高的mRNA,143个m6A甲基化水平降低的mRNA。进一步分析这些差异甲基化的基因表达变化，结果显示，在127个高甲基化的mRNA中，有107个表达上调，20个表达下调;在43个低甲基化的mRNA中，有9个表达上调，34个表达下调。 3.3哮喘患者的m6A修饰特征分析 3.3.1方法 利用GEO数据库，筛选哮喘患者与非哮喘志愿者不同类型样本的转录组表达数据集，并通过差异基因表达分析，观察哮喘患者不同类型样本尤其是支气管上皮细胞样本中m6A修饰相关酶基因表达等的变化情况。 3.3.2结果 从GEO数据库中下载并分析了70个哮喘疾病相关数据集，共有2609个哮喘患者和1478个非哮喘志愿者样本的基因表达谱数据。与非哮喘志愿者的数据相比，哮喘患者中无论是肺结构性细胞和组织（支气管上皮细胞、气道平滑肌细胞、鼻腔上皮细胞、肺活检组织、气道成纤维细胞），还是免疫细胞（外周血单个核细胞、总白细胞、嗜酸性粒细胞、CD4+和CD8+T细胞，巨噬细胞），或其他混合样本（外周全血、诱导痰、肺泡灌洗液），这些样本中的差异表达基因功能均涉及炎症与免疫调控等信号。m6A酶基因在哮喘患者的不同类型细胞和组织中均存在差异表达，但不同类型样本中差异表达的m6A酶基因各异。哮喘患者气道上皮细胞中m6A酶基因之间，以及m6A酶与差异表达基因之间，均存在不同程度的相关性和相互作用关系。 3.4木犀草素调控哮喘相关且m6A修饰变化的靶点预测 3.4.1方法 综合分析6个疾病相关数据库、13个药物相关数据库、11个哮喘患者气道上皮细胞GEO芯片以及上述小鼠肺组织MeRIP-seq等来源的数据，以识别哮喘中可能受木犀草素调控且m6A修饰水平变化的靶基因。 3.4.2结果 木犀草素调控的关键靶点有PTGIR、CASP3、INSR及PYCARD。该组基因既在哮喘状态下的表达水平显著变化，同时又是木犀草素的调控靶标，并且其m6A修饰水平均显著升高。 3.5哮喘气道炎症的m6A修饰机制研究 3.5.1方法 （1）使用屋尘螨（HDM）、脂多糖（LPS）及OVA这3种过敏原分别诱导3种气道上皮细胞系（BESA-2B、HBE、A549），共建立9种哮喘相关的体外模型，并在0、2、3、4、6、8、10、12、24小时后，观察上述模型的PYCARD相关的固有免疫反应表型变化。 （2）分别采用HDM、LPS及OVA诱导BEAS-2B细胞6h,观察其他固有免疫信号(AIM2、NLRP1、NLRC4、TLR1、TLR2、TLR5)表达、总RNA的m6A修饰等水平及转录组的变化情况。 (3)HDM诱导BEAS-2B细胞6h,观察14种m6A相关酶的表达、PYCARDmRNA的m6A修饰等水平的变化情况，以及PYCARDmRNA与YTHDF1蛋白的相互作用关系。 (4)METTL14或YTHDF1基因的小干扰RNA(siMETTL14或siYTHDF1)干预正常细胞或HDM诱导的BESA-2B细胞，观察PYCARD相关的固有免疫反应表型变化、总RNA的m6A修饰水平、转录组的变化情况，以及PYCARDmRNA的RNA稳定性。 (5)EMSA实验检测METTL3/METTL14蛋白复合物与PYCARDmRNA的相互作用关系。 3.5.2结果 (1)3种过敏原均能明显触发3种气道上皮细胞系中PYCARD相关的TLR4/NLRP3固有免疫信号。 (2)3种过敏原可不同程度地提高BEAS-2B细胞总RNA的m6A修饰水平，并激活BEAS-2B细胞多种其他固有免疫信号(AIM2、NLRP1、NLRC4、TLR1、TLR2、TLR5)。转录组数据分析结果显示，BEAS-2B细胞中受3种过敏原共同调控的基因有28个。 (3)HDM可显著上调BEAS-2B细胞内METTL14、YTHDF1、YTHDF2、IGF2BP1mRNA表达，显著下调METTL16mRNA表达，对METTL3、WTAP、FTO、ALKBH5、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2、IGF2BP2及IGF2BP3的表达无明显影响。HDM诱导的BEAS-2B细胞中PYCARDmRNA的m6A修饰水平明显升高，且其能与YTHDF1能直接结合，其结合水平显著高于对照组。 (4)siMETTL14能显著抑制HDM诱导的BEAS-2B细胞内RNA的m6A修饰水平;siMETTL14与siYTHDF1均能抑制HDM诱导的BEAS-2B细胞内PYCARD、IL-1B及IL-18的表达，还可降低PYCADRmRNA的稳定性。此外，转录组数据分析结果显示，受siMETTL14和siYTHDF1共同调控的基因有350个。 (5)METTL3/METTL14蛋白复合物与PYCARDmRNA之间存在直接结合关系。 3.6木犀草素抗哮喘气道炎症的机制研究 3.6.1方法 (1)木犀草素干预HDM、LPS、OVA诱导的BEAS-2B细胞，观察PYCARD相关的固有免疫信号表型、总RNA的m6A修饰水平、METTL14与YTHDF1的表达水平及转录组等的变化情况。 (2)木犀草素干预OVA诱导的哮喘小鼠模型，观察哮喘表型、BAFL中IL-1B及IL-18的表达水平，以及肺组织气道上皮细胞中PYCARD及METTL14与YTHDF1表达水平等的变化情况。 3.6.2结果 (1)木犀草素能显著下调HDM、LPS及OVA诱导的BEAS-2B细胞模型内PYCARD、YTHDF1、IL-1B、IL-18等的表达，但对METTL14的表达与总RNA的m6A修饰的水平无明显影响。转录组数据分析结果显示，3个细胞模型中共同受木犀草素调控的基因为KCNH1与LTB4R。 (2)木犀草素可显著改善小鼠的哮喘表型:包括降低哮喘小鼠的气道阻力，对肺顺应性有一定的提高趋势;降低哮喘小鼠BALF中的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等的数量;有效降低BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-1β、IL-18以及血清中IgE的含量;改善哮喘小鼠肺组织中气道周围炎症细胞浸润及黏液分泌情况。木犀草素还可下调哮喘小鼠气道内PYCARD及YTHDF1蛋白表达，对METTL14蛋白表达无显著影响。 4结论 (1)m6A修饰在哮喘疾病机制与治疗中可能具有重要作用。 (2)METTL14可能通过结合PYCARDmRNA而促进该RNA的m6A修饰。 (3)YTHDF1可能通过识别并结合PYCARDmRNA的m6A修饰位点而促进PYCARDmRNA的稳定性，从而上调相关固有免疫信号，加重哮喘气道炎症。 (4)木犀草素的抗哮喘气道炎症机制可能部分通过抑制YTHDF1介导的促PYCARDmRNA稳定性作用实现。
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