摘要
第一部分:慢性乙型肝炎功能性治愈者的临床特征分析 [背景及目的]乙肝表面抗原(HepatitisBsurfaceAntigen，HBsAg)转阴与肝功能改善、肝脏组织病理分期改善及慢乙肝患者的长期预后改善相关，是目前国内外指南推荐作为临床治疗慢乙肝的的理想治疗目标，也就是功能性治愈或临床治愈。但目前慢乙肝患者中实现功能性治愈率的占比仍较低，且仅部分患者合并HBsAg血清转换。另外有存在功能性治愈后复发的情况。本部分旨在通过分析功能性治愈者与未出现功能性治愈者的HBV病毒学相关指标、血清学指标、实验室指标等因素，分析与功能性治愈相关的临床指标。寻找功能性治愈的优势人群，探寻治疗中可以用于预测功能性治愈的获益因素，进一步对功能性治愈者的治疗后随访数据进行分析，探索与HBsAg复阳有关的临床指标。 [研究方法] 1.纳入接受Peg-IFNα治疗的HBeAg阴性慢乙肝患者共170例，根据停用Peg-IFNα时的HBsAg是否阴转，将入选患者分为功能性治愈者和未出现功能性治愈者。收集上述患者于本院随访时的人口学信息、HBVDNA、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBcAb、ALT、AST及治疗情况等信息;2.统计并比较两组患者基线时上述信息的差异和停用Peg-IFNα时上述人口学及实验室检查信息的差异;3.分析功能性治愈者中同时伴HBsAg血清转换的患者占比;4.对实现功能性治愈的慢乙肝患者在停用Peg-IFNα后随访出现HBsAg复阳的临床特征进行分析。 [结果] 1.通过比较HBeAg阴性的慢乙肝患者经Peg-IFNα治疗实现功能性治愈与未出现功能性治愈的基线的人口学信息、病毒学信息、血清学信息、生化指标及治疗情况，发现，两组患者基线的HBsAg存在显著差异。功能性治愈者基线的HBsAg水平低于未治愈患者，就治疗情况而言，基线时NAs或Peg-IFNα经治的慢乙肝患者更易获得功能性治愈。 2.进一步比较停用Peg-IFNα时两组患者的人口学信息、病毒学信息、血清学信息、生化指标及治疗情况，分析显示，Peg-IFNα治疗后2组患者的ALT均较基线上升，但在功能性治愈者中有更高水平的ALT上升倍数。功能性治愈者接受Peg-IFNα治疗周数长于未出现功能性治愈者。 除此之外，约66.1％的功能性治愈患者在停用Peg-IFNα时同时出现HBsAg血清转换，而仅有6.4％的未功能性治愈的HBeAg阴性的慢乙肝患者出现HBsAg血清转换，且数值较低。 3.HBsAg复阳的慢乙肝患者通过Peg-IFNα取得HBsAg清除的时间长于随访中未复发的功能性治愈者（36wvs48w,p=0.043） [结论] 1.基线时与功能性治愈与否关系密切的指标包括HBsAg水平、既往NAs和（或）Peg-IFNα治疗史:基线时HBsAg水平越低，越有可能通过Peg-IFNα治疗取得功能性治愈，既往通过NAs和（或）Peg-IFNα治疗史可以大大提高Peg-IFNα治疗后的HBsAg清除的几率; 2.治疗中ALT较基线的上升水平可作为功能性治愈的预测因素:Peg-IFNα治疗后2组患者的ALT均较基线上升，但在功能性治愈者中有更高水平的ALT上升倍数; 3.延长Peg-IFNα治疗疗程是CHB患者接受Peg-IFNα治疗实现功能性治愈的获益因素; 4.Peg-IFNα治疗中更快实现HBsAg阴转的CHB患者在停用Peg-IFNα的后续随访中出现复发可能性较小。 第二部分:抗HBsAg抗体Fab和Fc功能评估方法建立 [背景及目的]针对HBsAg特异性的HBsAb是机体对HBV具有保护性的标志。HBsAb发挥作用的机制包括: 1.通过其Fab段与HBV亚病毒颗粒直接结合，促进其从循环直接被清除; 2.其Fab段还可以通过结合于循环HBV病毒颗粒的胞膜蛋白HBsAg阻止HBV通过肝包膜表面HSPGs或NTCP进入肝细胞; 3.除了Fab段作用外，HBsAb通过其Fc段介导抗体依赖性细胞毒作用、抗体依赖性细胞吞噬作用、补体依赖的调理作用清除HBV及其感染的肝细胞。 而已有相当数量研究表明经不同免疫途径获得的HBsAb的保护能力及发挥作用的方式存在差异，相较于经疫苗接种后获得的HBsAb,自然感染后所产生的HBsAb具有更高的与HBsAg的亲和力和体外中和活性。 在本研究的第一部分的分析中，我们发现在接受Peg-IFNα治疗的慢乙肝患者停用Peg-IFNα时，近2/3的功能性治愈者伴随HBsAg血清转换，提示功能性治愈者的HBsAg特异性的B细胞的应答的有效运作。此外，有部分未实现功能性治愈的慢乙肝患者出现HBsAb阳性，那么该类患者的HBsAb是否能够有效发挥清除HBV的作用？ 本部分研究旨在建立HBsAb功能的检测方法，用以评估实现功能性治愈并HBsAg血清转换的慢乙肝患者的循环HBsAb是否具有保护性，以作为除了血清学检测HBsAb水平以外的辅助手段，以更全评估功能性治愈者的HBsAg特异性的体液免疫。 [研究方法] 1.通过补体依赖的细胞毒作用，即检测添加了HBIG和补体C1q复合物后的CFSE标记的PLC/PRF/5细胞的死亡占比作为评估HBsAbFc段功能的方式。 2.通过体外中和实验，即将梯度稀释的HBIG与HBV病毒株共孵育后加入HepG2-NTCP细胞系进行体外感染实验并检测每个梯度下的HBV感染的HepG2-NTCP细胞数作为评估HBsAbFab段的方式。 [结果] 1.基于HeG2-NTCP稳转细胞系构建了HBV感染的体外模型，并以此为基础建立了中和实验的方式用以评估HBsAb的Fab段功能 2.基于检测PLC/PRF/5细胞系与C1q补体复合体及HBIG共孵育建立了体外评估HBsAb的Fc段功能的检测手段 [结论]本部分建立了检测HBsAbFc段和Fab段功能的方法，可以用于评估实现功能性治愈并HBsAg血清转换的慢乙肝患者的循环HBsAb是否具有保护性，以作为除了血清学检测HBsAb水平以外的辅助手段，评估机体是否产生有效的HBsAg特异性的B细胞应答。 第三部分:HBsAg特异性T细胞功能评估方法的建立 [背景及目的]抗原特异性的T细胞应答是适应性免疫系统清除病毒的重要方式，现有多种检测抗原特异性T细胞的方式，其中通过抗原肽/MHC-多聚体直接检测抗原特异性T细胞是测定抗原特异性T细胞的金标准。但是，该检测手段只限于特定抗原肽表位和特定HLA分型。作为替代方案，功能测试提供了更大的灵活性，不受特定抗原表位及HLA分型影响。体外抗原刺激后，将抗原诱导的T细胞反应作为间接结果进行分析，表明特定的T细胞，即增殖、活化诱导的表面或分泌的分子或细胞毒性，从而反映抗原特异性T细胞的功能和/或数量。在慢性HBV感染中，HBV特异性T细胞应答表现为各方面的缺陷，T细胞无法对HBV抗原迅速应答并激活、增殖及分化产生效应功能，使得通过细胞免疫清除HBV的环节缺陷，共同参与到HBV感染慢性化的发生中。而HBV病毒抗原的持续存在，对抗原特异性的T细胞的发育再次进行塑造，使其进一步丧失对HBV各个抗原的反应性、降低其效应功能、增加其对凋亡信号的敏感性，即“克隆删除”。在当前临床诊疗中，直观的评估治疗过程中HBsAg特异性T细胞应答将有助优化协助调整诊疗方案。 在本研究的第一部分的分析中，比较Peg-IFNα治疗中ALT较基线的上升水平，我们发现在Peg-IFNα治疗后ALT上升，而功能性治愈者具有更高的ALT上升倍数，作为杀伤HBV感染的肝细胞的主力军，HBsAg特异性的T细胞可以以溶细胞和非溶细胞等方式杀伤肝细胞，那么在功能性治愈者中是否HBsAg特异性的T细胞应答有效建立参与杀伤肝细胞而使得ALT的水平上升？因此，有必要建立评估T细胞应答的检测方法。 本部分旨在通过检测HBsAg特异性T细胞在HBsAg抗原肽刺激后的活化程度以反应HBsAg特异性T细胞对HBsAg的反应性，进而评估HBsAg特异性T细胞的功能状态。 [研究方法]T细胞活化是抗原特异性T细胞应答的最先发生的环节，以HBsAg肽库体外刺激PBMC后检测CD69+CD25+细胞占总的CD3+T细胞的百分比反映HBsAg特异性T细胞应答。 [结果]通过活化诱导的标志物(activationinducedmarkerassay，AIM)实验可以检测对HBsAg刺激有效应答地T细胞数量，反应能够活化的T细胞，进而提示有功能的T细胞的占比。 [结论]相较于抗原肽/MHC-多聚体检测抗原特异性T细胞，使用AIM检测HBsAg刺激后发生活化的T细胞数目，既可以反应HBsAg反应性T细胞数，也可以反应T细胞的活化功能。本部分建立了HBsAg特异性T细胞功能评估的方法，可以用于评估实现功能性治愈者是否产生有效的HBsAg特异性的T细胞应答。 第四部分:PBMC单细胞测序分析慢性乙型肝炎功能性治愈者的免疫全景 [背景及目的]相较于急性自限性HBV感染，慢乙肝感染中HBV持续复制介导了淋巴细胞亚群功能失调和紊乱，慢乙肝患者的外周血中髓样树突状细胞(myeloiddendriticcell,mDC)和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoiddendriticcell,pDC)的丰度降低，且mDC成熟障碍，pDC产生Ⅰ型干扰素的能力明显降低。HBV特异性的效应性CD8+T细胞数量下降，且增殖受限极易凋亡，活化和产生细胞因子的能力严重受损，是慢性HBV感染免疫耐受的重要原因之一。近年来愈多文献报道长期持续的HBV的刺激下B细胞分化状态改变，增殖能力显著下降，功能耗竭的B细胞显著增多，从而导致免疫耐受状态的出现，而慢乙肝患者经治疗或自发实现功能性治愈后，固有免疫系统和适应性免疫系统的各个免疫原件的组成和功能发生何种变化，是否恢复了对HBsAg的应答进而产生相应功能，各个免疫原件对HBsAg恢复有效的免疫应答中是否存在相互协作，其相互协作是在HBsAg应答的哪个环节，目前尚未有研究系统地阐明上述问题。单细胞转录组测序技术(single-cellRNA-sequencing,scRNA-seq)是近年来广泛应用的一项高通量测序技术，其可在单个细胞水平上对其进行高通量转录组分析，可以更为全面而精准地解析在复杂的疾病背景中影响治疗应答的关键细胞亚群及其功能状态，进而系统性揭示治疗应答的机制。本部分期望借助高细胞通量的单细胞测序技术，系统性地阐述在功能性治愈后固有免疫和适应性免疫中与有效清除HBsAg的关键细胞及其功能状态的改变，进一步寻找在功能性治愈中发挥重要作用的细胞及分子。 [研究方法] 1.样本收集及单细胞测序:动态收集接受Peg-IFNα治疗的慢乙肝患者治疗基线和治疗48周时的外周血样本，分离并冻存外周血单个核细胞(peripheralbloodnucleuscells,PBMC)。最终选取3例实现功能性治愈并HBsAg血清转换的慢乙肝患者治疗基线和治疗48周的PBMC和3例相同治疗方案治疗48周HBsAg下降＜1log10IU/ml(HBsAg血清学无应答)的慢乙肝患者治疗基线和治疗48周时的PBMC。经复苏后加入HBsAg肽库体外孵育18小时后，利用10xGenomics单细胞测序技术平台进行建库、转录组联合免疫组库测序，测序数据经过质控过滤后生成表达矩阵进入生物信息学分析流程; 2.生物信息学分析转录及免疫组库信息:使用Scanpy进行转录组分析，分析流程主要为数据过滤、质控、批次效应矫正、高变基因选择、PCA降维、leiden聚类、细胞注释、差异基因计算、富集分析。 3.生物信息学下游分析:使用Scanpy的score_genes算法评估免疫应答各环节的主要参与细胞及其功能的动态变化并寻找与IFN治疗应答相关的主要细胞。 [结果] 1.从6例患者共12个标本中一共获得103047个单细胞，21个细胞群，根据各群细胞的差异基因表达特征，注释出T细胞系、B细胞系、NK细胞群、单核吞噬细胞系等主要免疫细胞类型。B细胞分为初始B细胞和记忆性B细胞，单核吞噬细胞系依据谱系标志物分为经典CD14+单核细胞、中间态单核细胞CD14+CD16+单核细胞、非经典单核细胞CD16+单核细胞、成熟态树突状细胞CCR7+DC,NK细胞的谱系标志物则为KLRF1,T细胞根据其增殖、分化、效应功能及抑制性标志基因进一步分为初始T细胞Tnaive、中心记忆性T细胞Tcm、耗竭前体T细胞Tpex、效应记忆性T细胞Tem、效应性T细胞Teff。Tpex、Tem、Teff均表达T细胞激活和杀伤效应的标志物，据此将其归类为活化的效应性T细胞群。进一步比较各细胞群的组别间及动态变化，发现B细胞群、活化的效应性T细胞群在Peg-IFNα治疗后取得功能性治愈的慢乙肝患者中相对丰度提升。差异基因富集分析提示Peg-IFNα治疗后功能性治愈者的PBMC富集Ⅰ型干扰素信号通路，且富集有促进细胞增殖的信号通路，提示功能性治愈者有更高的干扰素应答率和更强的增殖潜力。 2.对单核吞噬细胞系二次降维聚类，并依据差异基因表达模式鉴定出经典单核细胞、中间态单核细胞、非经典单核细胞、表达抗病毒相关ISGs的单核细胞、浆细胞样树突状细胞、传统树突状细胞、高表达CCR7的树突状细胞。中间态单核细胞的相对丰度经Peg-IFNα治疗后提升，但在功能性治愈组提升更为显著，对该细胞群进行Peg-IFNα治疗前后的差异基因富集分析发现其在Peg-IFNα治疗后富集抗原加工呈递及促进T细胞应答的通路。 3.提取T细胞和NK细胞亚群进行再次聚类分析，在谱系基因的基础上，进一步根据增殖、活化、效应、抑制性标志物对T细胞进行注释，CD4+T细胞分为初始CD4+T细胞(CD4+Tnaive)、中心记忆性CD4+细胞(CD4+Tcm)、调节性T细胞(Treg)。CD8+T细胞包括初始CD8+T细胞(CD8+Tnaive)，效应记忆性CD8+T细胞(CD8+Tem)，细胞毒性CD8+T细胞(CD8+Teff)，具有增殖潜力的耗竭前体T细胞(Pre-exhaustedTcells,Tpex),Tpex同时具有效应分子和增殖相关标志物TCF-7的表达。依据表达激活和杀伤效应标志物与否将CD8+Tem、CD8+Teff、Tpex归类为活化的效应性T细胞群。另外还鉴定出黏膜相关恒定T细胞(MAIT细胞)、γδT细胞及NK细胞。比较组别间T细胞构成及其动态变化，功能性治愈者具有最高丰度的活化的效应性T细胞，其3群活化的效应性T细胞群的丰度较Peg-IFNα治疗前均提升，而血清学无应答者的患者在Peg-IFNα治疗后其活化的效应性T细胞群中仅CD8+Tem稍有提升。 4.TCR测序发现优势TCR克隆主要富集于功能性治愈者，联合转录组数据发现优势克隆对应的T细胞群为活化的效应性T细胞群。功能性治愈者中效应性T细胞群构成的优势克隆在Peg-IFNα治疗后进一步扩增，且发生克隆扩增的细胞主要为具有更高增殖潜力的Tem和Tpex。而在血清学无应答者的优势克隆以Teff为主，该细胞群在治疗后未进一步克隆扩增。 5.对B细胞二次降维聚类分析，根据谱系标志物、发育状态、活化及浆细胞分化程序进行注释，得到初始B细胞，浆细胞，静息记忆性B细胞，活化记忆性B细胞(B_memory_act);中间过渡记忆性B细胞亚群(B_memory_pb)。B_memory_pb表达与浆细胞分化相关转录因子PRDM1,提示该群细胞经历浆细胞分化命运。此外，B_memory_act和B_memory_pb表达高水平的整合素家族基因，该家族基因与T细胞经TCR刺激后活化相关，提示B_memory_act和B_memory_pb可能具有促进T细胞应答的功能。比较组别间B细胞构成及其动态变化，功能性治愈者具有最高丰度的活化的记忆性B细胞群B_memory_act和B_memory_pb,且动态分析提示上述2群B细胞丰度均较Peg-IFNα前提升，其中以B_memory_pb提升更为显著。而在血清学无应答者中记忆性B细胞群体没有显著的扩增及活化现象。 6.BCR测序结果明确了活化的记忆性B细胞和启动浆细胞分化程序的记忆性B细胞在功能性治愈者中的克隆扩增; 7.抗原处理和呈递环节评分显示，单核细胞系和B细胞系是慢乙肝感染中主要的抗原呈递细胞，功能性治愈者的上述2个细胞系具有最高的抗原处理和呈递环节评分，且均较Peg-IFNα治疗前上升。通过HLA-Ⅱ类基因在组别间的表达量差异进一步验证上述结论。 8.TCR信号通路评分提示B细胞和单核细胞也参与TCR信号通路调控。功能性治愈者具有最高的TCR信号通路评分，且上述2个细胞系的TCR信号通路评分在Peg-IFNα治疗后提高。通过使用经TCR活化T细胞的基因集评分进一步明确单核细胞在Peg-IFNα治疗后提升了刺激促进T细胞的功能。 9.BCR信号通路评分发现除B细胞外，单核细胞及NK细胞系是主要参与到BCR信号通路的细胞群。功能性治愈者具有最高的BCR信号通路评分，并且激活的效应性T细胞群也参与BCR信号调控。 10.IFNR评分发现单核吞噬细胞系具有最高的IFNR受体的评分，UMAP查看IFNA受体的细胞分布进一步验证了IFNAR1主要分布在单核吞噬细胞系。Ⅰ型干扰素通路相关基因的细胞分布提示，PBMC中以单核吞噬细胞系含有最多的Ⅰ型干扰素通路相关基因。此外，功能性治愈者具有最高的Ⅰ型干扰素通路相关基因。 [结论] 1.通过10x单细胞转录组测序分析识别有效的HBsAg特异性免疫应答中的关键原件，其中功能性治愈者中中间态单核细胞、效应性T、B细胞扩增参与到有效的HBsAg特异性免疫应答的建立中; 2.从HBsAg识别到效应的HBsAg特异性的T、B细胞应答的激活的各个环节有多种细胞组分在不同阶段互相协作。单核细胞系和B细胞系是主要参与抗原处理及呈递的细胞，TCR应答涉及B细胞和单核细胞系的参与，BCR信号受到单核细胞系和NK细胞系的参与，功能性治愈者的T细胞也参与BCR调节; 3.HBsAg应答的各个主要环节在Peg-IFNα治疗后取得功能性治愈的慢乙肝患者中均明显活化，且细胞间协作能力增强，提示慢乙肝患者在Peg-IFNα治疗实现功能性治愈后建立了有效的HBsAg特异性免疫应答; 4.通路富集及IFN-Ⅰ相关基因评分分析提示功能性治愈者对Peg-IFNα治疗的响应程度更高。 第五部分单细胞测序数据的验证 [背景及目的]有效的清除HBV感染有赖于固有免疫和适应性免疫各类免疫细胞的有效运转及互相协作，单细胞测序中发现功能性治愈者固有免疫和适应性面一种多种效应性细胞扩增且协同参与清除HBsAg的各个环节。抗原递呈环节中，单核细胞以CD14+CD16+中间态单核细胞的增多及效应功能提升参与到抗原加工呈递环节。活化的效应性T细胞在功能性治愈者中的克隆扩增意味着T细胞对HBsAg的响应且发挥效应功能。活化的记忆性B细胞群的增多使得有更多具备浆细胞分化命运的B细胞产生，除此之外,记忆性B细胞还参与到T细胞应答。而上述细胞在慢乙肝免疫耐受中的缺陷均有所报道，上述细胞在建立有效的HBsAg特异性免疫应答中各有十分重要的地位，本部分将进一步在验证队列中评估功能性治愈者的免疫系统是否有效运作进而实现对HBV的控制。 [研究方法] 1.收集健康对照、未经治疗的慢乙肝、功能性治愈者、治疗后HBsAg血清学无应答者的PBMC通过流式细胞术检测单核细胞亚群; 2.使用第三部分建立的通过激活诱导的标志物实验检测健康对照、未经治疗的慢乙肝、功能性治愈者、治疗后HBsAg血清学无应答者的被HBsAg肽库刺激后活化的T细胞占比; 3.使用第二部分建立的评估HBsAb的Fc段和Fab段的方法学评估测HBsAg血清转换的功能性治愈者的HBsAb的功能。 [结果] 1.在流式细胞术中也明确了中间态单核细胞的相对丰度高于未经治疗的慢乙肝患者和血清学无应答的慢乙肝患者，验证了单细胞测序中功能性治愈者具有更多参与抗原递呈及促进HBsAg特异性适应性免疫应答的中间态单核细胞; 2.功能性治愈者具有最高的对HBsAg刺激产生活化的T细胞占比，说明功能性治愈者的T细胞应答有效运作; 3.功能性治愈者的HBsAb具有CDC活性，部分患者还有中和活性，说明HBsAb可以通过Fc段和Fab段发挥保护性。 [结论] 1.功能性治愈者具有更多具备抗原加工及呈递功能的中间态单核细胞，说明功能性治愈后抗原递呈环节进一步改善; 2.功能性治愈者的T细胞被HBsAg刺激后发生活化的占比显著提升，即T细胞应答在功能性治愈后显著改善; 3.功能性治愈并HBsAg血清转换后产生保护性HBsAb,提示B细胞应答在功能性治愈后有效运作。
NETL