摘要
在这项研究中，我们用双膦酸盐功能化透明质酸(HA-BP)与纳米羟基磷灰石(HAP)交联构建了一种可注射的水凝胶，并且通过负载骨髓间充质干细胞来源的外泌体增强了骨修复能力，有效地调节成骨细胞的活性。HA-BP可以抑制破骨细胞的活性，而水凝胶携带的羟基磷灰石晶体可以作为骨缺损部位的骨补充剂。最后通过细胞实验以及构建骨质疏松椎体骨缺损兔模型来验证生物活性材料和可注射性，以及对成骨细胞、破骨细胞双向调节的作用。主要研究内容如下: 第一章HA-BP·HAP/BMScExo复合活性材料的构建及其表征 目的:利用点击化学原理构建双膦酸盐(BP)功能化透明质酸(HA)，与羟基磷灰石交联形成可注射水凝胶。通过表征HA-BP·HAP/BMScExo的理化性质和功能。 方法:合成并检测HA-BP·HAP的理化性质，2％HA-BP+6％HAP构建成胶体系，利用流变仪和核磁共振波谱法验证材料合成完成与物理性质;以差速离心法提取并分离外泌体，用纳米颗粒追踪技术(NTA)，蛋白免疫印迹法鉴定外泌体，负载至HA-BP·HAP形成HA-BP·HAP/BMScExo,最后将复合材料置于不同温度、不同PH条件下，酶联免疫吸附检测(ELISA)检测外泌体的释放情况。 结果:核磁共振波谱法(NMR)鉴定硫醇键的形成以及BP在HA上成功接枝。流变仪测试结果振幅扫描结果表明HA-BP·HAP在剪切应变的重复的作用下，水凝胶的储能模量在(G'')可以立即恢复，时间扫描结果表明在低(60％)-高(800％)剪切应变重复变形下，在≈300％剪切应变时表现为出现了凝胶-液体的转变。且负载外泌体后HA-BP·HAP/BMScExo剪切稀释性和自愈合性仍然存在，无明显变化。NTA结果发现外泌体直径均在105nm左右，蛋白质免疫印迹法表明外泌体CD9、CD63、CD81阳性。ELISA结果表明HA-BP·HAP/BMScExo在的释放能力在PH=4时最高，并且随着PH的增加释放能力逐步衰减。在不同温度下，表现出在38°时释放能力最高，当温度至44°时释放能力下降。 结论:利用双膦酸盐功能化透明质酸能够与HAP形成水凝胶，具备良好的物理性质。在外泌体提取部分，能够成功分离外泌体。并且外泌体可以融入成胶体系，HA-BP·HAP/BMScExo表现出了在酸性环境以及体内温度下高效释放外泌体的能力。 第二章HA-BP·HAP/BMScExo对破骨细胞以及成骨细胞影响的体外评价研究 目的:通过与前体成骨细胞和前体破骨细胞的共培养验证HA-BP·HAP/BMScExo对二者的双向调节作用，并验证其生物相容性。 方法:将前体成骨细胞分别接种在常规培养基+生理盐水、DXM、DXM+BMScExo、DXM+HA-BP·HAP、DXM+HA-BP·HAP/BMScExo分5组进行培养，分别于第3天、7天、14天进行细胞活力测定以及活死细胞染色，第7天、14天进行茜素红和碱性磷酸酶染色，同时在第14天检测Runx-2、BSP、OPN、OCN、Col-1、ALP蛋白的表达检测。对BSP、OPN、OCN、Col-1、ALP进行实时荧光定量PCR检测基因表达。前体破骨细胞分别接种在接种在常规培养基、HA-BP·HAP、HA-MC分3组进行培养，于共培养后7天进行活死细胞染色、细胞活力检测;7天、14天抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)并进行半定量分析:检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)、组织蛋白酶K(CathK)和碳酸酐酶Ⅱ(Ca-Ⅱ)的表达情况;于共培养24小时后进行破骨细胞细胞核、caspase-3、F-肌动蛋白荧光染色。 结果:在成骨细胞部分，通过CCK-8试剂盒、活死细胞染色细胞半定量分析表明在培养7天、14天后HA-BP·HAP/BMScExo组细胞活力高于BMScExo组(p＜0.001);死细胞计数显著低于BMScExo组(p＜0.001);细胞共培养14天后Runx-2、BSP、OPN、OCN、Col-1、ALP蛋白的表达量HA-BP·HAP/BMScExo组显著高于BMScExo组(p＜0.01)，BSP、OPN、OCN、Col-1、ALP等成骨相关基因的表达量HA-BP·HAP/BMScExo组显著高于BMScExo组(p＜0.001);茜素红(ARS)和碱性磷酸酶染色及半定量分析结果也同样印证了这一情况。 结论:结合CCK-8、活死细胞染色的结果，表明HA-BP·HAP/BMScExo具备在大剂量DXM条件下促进成骨能力，并且在培养时间较长的情况下更加明显。HA-BP·HAP/BMScExo的缓释能力能够充分刺激成骨相关基因以及蛋白质的白表达。 第三章HA-BP·HAP/BMScExo复合活性材料治疗骨质疏松性椎体骨缺损的动物实验研究 目的:利用骨质疏松性椎体骨缺损兔模型验证HA-BP·HAP/BMScExo复合活性材料在体内的修复效果。 方法:通过卵巢切除术联合糖皮质激素诱导骨质疏松动物模型，构建完成后在兔第六腰椎处构建椎体骨缺损模型，随后分别填充同体积生理盐水、外泌体悬浮液、HA-BP·HAP、HA-BP·HAP/BMScExo。于12周后取出椎体进行Micro-CT、、HE染色和免疫组化染色评估骨修复情况。分别于6周，12周取取出椎体进行Masson染色。 结果:在前期实验的基础上骨质疏松模型构建后，兔体重显著增加(p＜0.001)，骨密度显著下降。Micro-CT结果提示HA-BP·HAP/BMScExo组骨体积分数(BV/TV)和骨小梁数(Tb.N)显著高于其他组;马松染色结果提示HA-BP·HAP/BMScExo组缺损内部骨长入情况较好;HE染色结果表明HA-BP·HAP/BMScExo具备更多的骨组织，更少的炎症细胞;免疫组化染色结果表明HA-BP·HAP/BMScExo与HA-BP·HAP组OPN、OCN表达量更多。 结论:Micro-CT影像学以及病理组织学结果表明HA-BP·HAP/BMScExo骨修复情况显著好于单独使用BMScExo、HA-BP·HAP。表明复合活性生物材料具备在骨质疏松条件下骨修复的能力。 第四章BMScExo调控成骨细胞的分化，增殖的机制探索研究 目的:探究BMScExo促成骨机制。 方法:通过利用agomir-25,antagmir-25抑制或刺激成骨细胞内miRNA-25表达并通过差速离心法分离外泌体后，建立大剂量DXM条件下与前体成骨细胞共培养，14天后对成骨相关蛋白Runx-2、OCN、OPN、BSP进行蛋白质及相关基因表达检测。分别于7天、14天进行碱性磷酸酶、茜素红染色并进行半定量分析以验证成骨情况。随后分别将正常表达miRNA-25、抑制表达(miRNA-25-inhibitor)、过表达miRNA-25(miRNA-25-mimic)的外泌体与前体成骨细胞共培养后，分析SMURF1和PTEN的表达情况。 结果:在大剂量DXM培养环境下，抑制miRNA-25表达后成骨相关蛋白和基因表达显著下降(p＜0.001),碱性磷酸酶染色和茜素红染色以及半定量分析结果也同样反映了这一情况。过表达miRNA-25后骨相关蛋白和基因表达显著增加(p＜0.001)过表达miRNA-25后SMURF1和PTEN的表达显著下降(p＜0.001)。 结论:miRNA-25具有促进前体成骨细胞的分化能力，通过参与SMURF1和PTEN的表达调控成骨细胞的分化潜力。
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