摘要
据2021年公布的第七次全国人口普查数据显示，我国60岁及以上老年人口已达2.64亿，占全国总人口的18.7％。伴随人口老龄化的加剧，我国骨质疏松症发病率和人数也逐年增加，而目前市面上相关治疗的药物的副作用都较大，所以预防和治疗骨质疏松具有重大的现实意义和科研价值。牛骨胶原经蛋白水解后获得的胶原蛋白多肽具有丰富的人体必需氨基酸，容易被人体吸收，是市面上胶原营养品的重要成分来源。有临床试验表明一些食品源的胶原水解复合产物具有一定的抗氧化和抗骨质疏松等功能。但是，食品源的胶原水解复合产物，例如酶解的牛骨胶原复合产物，组成复杂，很难阐明其在体内的机理和真正具有功能的活性成分。因此，从酶解的产物中开发出具有生物活性的多肽，阐明其发生功效的机制，将十分有助于发挥出胶原多肽更高的应用价值，可以应用到保健类食品、药品开发等领域。 本论文基于课题组挖掘的胶原蛋白酶，通过酶解牦牛骨胶原蛋白粗液以及分离收集酶解产物，然后通过反向液相色谱串联质谱技术鉴定产物中的多肽组成。以ABTS·自由基、DPPH·自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基清除实验来筛选多肽库中具有体外抗氧化活性的多肽。以秀丽隐杆线虫为动物模型，研究活性多肽在体内的抗氧化和抗衰老的功效，以及作用机制。此外，以MC3T3-E1细胞模型，开发促进成骨的活性功能多肽，研究其潜在的机制。该项研究为延缓衰老、预防治疗骨质疏松的食品和药品开发提供了可供选择的多肽及其理论依据。 本论文的主要工作包括以下四个部分: （1）采用课题组研发的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）来源的胶原蛋白酶分解牛骨胶原蛋白粗液，分离且鉴定出酶解产物的成分，获得245条胶原及非胶原多肽库,库中多肽的分子量分布在500到2800Da之间，其中分子量小于1500Da的多肽共有180条，占全库的73.47％。通过调研分析比较，从库中挑选并合成了15条多肽进行体外活性验证，体外抗氧化试验表明13条水溶多肽均具有抗氧化活性，在DPPH·自由基和超氧阴离子自由基清除实验中，各肽的活性差异较大。综合来说，多肽UU1（GASGPMGPR）和多肽KC7（GLPGPM）在所有体外自由基清除试验中都有较好的清除活性，表现较为全面。 （2）以秀丽隐杆线虫（C.elegans）作为动物模型，分别研究了同为0.1mg/mL的浓度下多肽UU1和KC7对线虫正常寿命、热激环境下的寿命、运动性能、繁殖能力、体内ROS和MDA积累量，以及过氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT的活性影响。此外还从抗氧化、压力抵抗相关调节基因入手，研究活性多肽抗氧化的调节机理。结果显示，多肽UU1对线虫寿命周期有延长效果，还能提高线虫的繁殖能力，改善热应激，且能明显增强SOD和CAT的活性，降低MDA和ROS的水平，能够上调抗氧化应激相关基因daf-16、sir-2.1、sod-3和skn-1的转录。相比之下，KC7具有更佳的延长线虫寿命和增强线虫抗热应激能力的效果，能够促使线虫产生了更多的后代，甚至缩短产卵期。与对照组相比，0.1mg/mL的KC7处理组中，线虫体内ROS的积累量降低了17.89％,CAT活性提高了101.80％。KC7对daf-16、sod-3、skn-1转录水平的上调程度几乎是UU1组的一倍左右，且只在KC7组中观察到了hsf-1的转录水平的增加。 （3）考察多肽UU1对MC3T3-E1细胞增殖、细胞周期、分化、凋亡和矿化的影响。结果显示，多肽UU1能同时激活MC3T3-E1细胞中的Akt和β-catenin信号通路基因转录和蛋白的表达。UU1还能促进细胞增殖分化，增加碱性磷酸酶ALP、CyclinD1、Runx2、CollagenⅠ和Ocn蛋白的表达量。另外，随着胶原多肽UU1的添加浓度升高，MC3T3-E1细胞中Bax/Bcl-2蛋白的表达比也随之降低。胶原多肽UU1呈现出良好的促进成骨活性，能够加速MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化，甚至可望帮助延缓细胞凋亡。综合看来，在25和50μg/mL两个浓度下UU1的表现较为突出，在骨保护和骨质疏松症效治疗方面都有巨大的应用潜力。 （4）在MC3T3-E1细胞中研究了多肽KC7的促成骨活性。与对照组相比,KC7能够促进细胞增殖;且在12.5μg/mL的KC7处理下，细胞内ALP酶活性和ALP基因的表达量能同时增加。在12.5μg/mL和25μg/mL两个低浓度下，KC7都能明显的提升分化相关重要基因Runx2、Osterix、Ocn、Col2等的表达量。三个浓度下KC7都能提高Runx2和CollagenⅠ蛋白的量来助力细胞分化，且能明显的加快矿化的速度。此外,KC7对β-catenin因子的调控方式是浓度依赖型;而对Ocn蛋白表达量、Akt蛋白的磷酸化水平的提升和Bax/Bcl2比例的下调都只出现在12.5μg/mL浓度下。所以，KC7是具有促进成骨活性的多肽，其在低浓度下对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的加速，凋亡的延缓似乎更有益处。
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