摘要
第一部分探究丙酮酸激酶PKM2在骨关节炎软骨中表达上调 目的:观察丙酮酸激酶肌肉型(Pyruvatekinasemuscleisoform，PKM)不同亚型(PKM1,PKM2)在人和小鼠正常软骨和骨关节炎(Osteoarthritis，OA)软骨中的表达差异。 方法:收集临床正常软骨和OA患者软骨标本，收集2月龄和18月龄小鼠软骨标本。通过内侧半月板失稳术(Destabilizationofmedialmeniscus，DMM)建立小鼠OA模型，收集造模小鼠软骨标本。运用番红固绿染色检测软骨完整性，免疫组化或免疫荧光染色检测PKM2、PKM1等蛋白的表达情况。GEO(GeneExpressionOmnibus,基因表达库)数据库检索DMM小鼠和白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)处理的软骨细胞数据集，生信分析糖酵解相关代谢酶的表达。 结果:番红固绿染色显示与正常软骨相比，OA患者关节软骨破坏更严重，Mankin组织学评分增高。软骨免疫组化染色及半定量结果显示OA患者关节软骨PKM2、基质金属蛋白酶(Matrixmetallopeptidase,MMP)13表达更高，二型胶原(CollagentypeⅡalpha1chain,COL2A1)和聚蛋白聚糖(Aggrecan，ACAN)表达更低，PKM1在两者间表达均较低且无明显差别。与2月龄年轻小鼠比较，18月龄老年小鼠关节软骨退变较严重，OARSI(OsteoarthritisResearchSocietyInternational,国际骨关节炎研究协会)骨关节炎评分更高。免疫荧光染色及半定量结果显示老年小鼠软骨PKM2、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(Cyclindependentkinaseinhibitor2A,CDKN2A/p16INK4a)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白1A(Cyclindependentkinaseinhibitor1A,CDKN1A/p21)表达更高，PKM1在两者间表达均较低且无明显差别。小鼠OA模型建立8周后，番红固绿染色显示软骨破坏，OARSI骨关节炎评分增高。免疫荧光染色及半定量结果显示PKM2表达更高。在人关节软骨中，PKM2主要表达于正常软骨深层，而在OA患者软骨全层都有PKM2表达。在小鼠正常膝关节中，PKM2主要表达于软骨、半月板、骨髓腔等部位，不表达于滑膜，老年和DMM小鼠半月板PKM2表达水平高于各自对照。GEO数据集显示己糖激酶2(Hexokinase2,Hk2)、果糖-2,6-二磷酸酶3(Fructose-2,6-biphosphatase3,Pfkfb3)、磷酸甘油酸激酶1(Phosphoglyceratekinase1,Pgk1)等糖酵解代谢酶在OA软骨细胞中mRNA水平增加。 结论:PKM2,而非PKM1在人OA软骨，小鼠OA模型和老年小鼠软骨组织中表达上调。 第二部分PKM2调控软骨细胞衰老的机制研究 目的:体外探究敲减PKM2对软骨细胞衰老表型和葡萄糖代谢(糖酵解和三羧酸循环)及能量代谢的影响。 方法:提取5-6日龄乳鼠膝关节原代软骨细胞，体外IL-1β刺激建立OA细胞模型，连续传代建立细胞衰老模型。通过RT-qPCR、Westernbloting和免疫荧光染色分别检测mRNA水平和蛋白表达。Seahorse细胞代谢实验检测细胞糖酵解代谢速率，ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量。流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)水平。使用小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)转染软骨细胞敲减PKM2。运用RNA-seq技术比较PKM2敲减后软骨细胞内基因表达差异。 结果:IL-1β刺激后软骨细胞PKM2蛋白和mRNA表达水平显著上调。敲减PKM2对软骨细胞的凋亡和氧自由基水平无明显影响。Westernbloting显示PKM2敲减能促进软骨细胞的细胞外基质蛋白合成，对自噬水平无明显影响。RNA-Seq显示在软骨细胞中敲减PKM2能下调p16INK4a水平，上调部分细胞外基质蛋白水平，提示PKM2蛋白可能与软骨细胞衰老相关。在连续传代的衰老软骨细胞中p16INK4a表达上调，PKM2和COL2A1表达下调。敲减PKM2能部分逆转IL-1β刺激和连续传代造成的软骨细胞表型丢失。Seahorse代谢实验显示衰老软骨细胞糖酵解速率降低，而IL-1β刺激能明显上调细胞糖酵解速率，敲减PKM2能降低IL-1β诱导的糖酵解速率上调。敲减PKM2还能促进细胞ATP含量增加。 结论:敲减PKM2能下调p16INK4a表达水平，促进COL2A1合成，缓解软骨细胞衰老。同时，敲减PKM2能促使软骨细胞代谢由糖酵解转向三羧酸循环，促进ATP合成。 第三部分DMM小鼠关节腔内注射PKM2siRNA缓解软骨破坏 目的:体内实验探究敲减软骨细胞PKM2对软骨的保护作用。 方法:2月龄小鼠行内侧半月板失稳术，术后关节腔内注射NC或PKM2siRNA连续8周，收集膝关节软骨标本，进行番红固绿染色和PKM2等指标的免疫荧光染色。 结果:与注射NCsiRNA相比，PKM2siRNA组小鼠软骨细胞PKM2水平下调，番红固绿染色显示关节软骨退变减轻，免疫荧光染色及半定量结果显示COL2A1表达增高，MMP13表达降低。 结论:DMM小鼠关节腔内注射PKM2siRNA能下调软骨细胞PKM2的表达，缓解关节软骨破坏。
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