摘要
肿瘤液体活检通过检测生物体液中的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,CTC)、外泌体与肿瘤来源的DNA等靶标，提供了实时、动态、丰富的生理和病理信息，对于非入侵性的肿瘤诊断、预后评估、疗效监测、复发预测、肿瘤转移与耐药性研究具有重要意义。传统的群体细胞分析掩盖了细胞间的异质性。单细胞转录组分析在单细胞水平上分析基因的表达情况，揭示了细胞间的异质性。近年来，凭借着样本与试剂消耗少、反应速度快、检测灵敏度高、自动化、微型化、集成化、高通量、流体可控性强、生物相容性好等优点，微流控技术已经被广泛用于肿瘤液体活检与单细胞分析领域。然而，由于CTC数量少、异质性强、背景细胞干扰大等原因，当前基于微流控芯片的CTC检测方法存在CTC富集效率低、纯度低、释放困难、释放后细胞活性低等问题。此外，由于CTC在浓缩、转移与单细胞捕获过程中容易丢失，当前所发展的基于微流控芯片的单细胞分析方法不适用于高效、并行化的单CTC转录组分析。针对以上问题，本文发展了多种创新的微流控方法，实现了CTC的高效捕获与可控释放，以及低损耗与并行化的单细胞转录组测序，主要开展了以下工作。 (1)刺激响应性的微流控界面用于无创的骨髓瘤评估 提出了基于小分子刺激响应的微流控界面调控策略，建立了循环骨髓瘤细胞的高效捕获、可控释放与细胞遗传学分析的微流控方法。通过构建CD138抗体功能化的鱼骨形芯片，并在微流控界面与CD138抗体之间引入二硫键linker,实现了循环骨髓瘤细胞的高效捕获与可控释放。通过对循环骨髓瘤细胞进行免疫荧光染色与计数分析，实现了对多发性骨髓瘤患者的治疗效果进行监测。进一步通过荧光原位杂交实验，实现了对循环骨髓瘤细胞进行染色体异常分析。我们的方法具有采样入侵性低、样本处理速度快、靶细胞捕获效率高与可控释放、释放的细胞与遗传学分析兼容等优点，为无创的骨髓瘤评估提供了新机遇。 (2)仿生多价核酸适体“攀援者”功能化的微流控芯片用于高灵敏度的微小残留病检测 提出了仿生多价结合的策略，建立了基于多价核酸适体“攀援者”的高灵敏度微小残留病检测的微流控方法。通过自由基共聚反应，合成了具有柔性骨架的多价核酸适体聚合物，显著提高了复杂环境中核酸适体对靶细胞的亲和力。进一步结合基于确定性侧向位移原理的微流控芯片，构建了协同尺寸分离与多价核酸适体亲和捕获的微流控方法，实现了高灵敏度的白血病微小残留病检测。利用核酸酶降解多价核酸适体聚合物，实现了高效、无损地释放残留白血病细胞。我们的方法具有采样入侵性低、细胞捕获效率高、纯度高、释放效率高等优点，为无创的、高灵敏度的微小残留病检测以及提供了新机遇。 (3)DNA编程的取向有序多价核酸适体微流控界面用于肿瘤液体活检 提出了DNA编程的微流控界面配体取向调控策略，建立了基于取向有序的多价核酸适体的CTC高效捕获与可控释放的微流控方法。通过DNA自组装，获得了取向有序的多价核酸适体纳米结构，显著提高了核酸适体的靶细胞可及性和利用率。进一步结合鱼骨形芯片，构建了取向有序的多价核酸适体微流控界面，实现了CTC的高效捕获。通过核酸酶降解DNA组装体的方法，实现了高效、无损的CTC释放。最后，通过对释放的细胞进行T细胞受体测序，揭示了与治疗反应相关的T细胞克隆动力学。我们的方法具有采样入侵性低、样品处理速度快、CTC捕获及释放效率高、核酸适体利用率高、释放后的CTC与转录组测序兼容等优点，为微流控的界面调控提供了一种新范式，并促进了基于核酸适体的液体活检的临床应用。 (4)基于配对芯片的单循环肿瘤细胞高效捕获与并行化转录组测序 提出了基于“流阻差异”原理的高效单CTC/单DNA编码微球配对捕获策略，建立了并行化单CTC转录组测序的微流控方法。根据“流阻差异”原理，设计了集成微阀微泵的配对芯片，实现了高效的单CTC与单DNA编码微球的配对捕获。通过精准地操控微阀微泵，实现了在芯片上顺序地生成配对液滴、快速混合液滴、裂解细胞、捕获mRNA、清洗游离的mRNA、进行逆转录和酶切反应。随后，回收捕获了mRNA的DNA编码微球进行cDNA扩增、构建测序文库、进行高通量测序，实现了并行化的单CTC转录组测序。我们的方法具有CTC和编码微球利用率高、检测灵敏度高、游离mRNA的污染小、并行化单细胞分析等优点，为CTC的异质性研究提供了一种有效的工具。
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