摘要
真菌通过有性生殖排除有害突变并产生多样化的基因型来适应自然环境。真菌交配型(mating-type,MAT)基因座上的MAT基因调控真菌的有性生殖过程，此外它还调控真菌无性生殖、次级代谢以及其他非生殖相关生命活动。在圆盘菌科真菌中有性无性的对应机制的确立，以及捕食线虫真菌的发现，使其成为了研究真菌有性生殖的首选对象。课题组在前期工作中成功构建圆盘菌科少孢属捕食线虫真菌A.oligosporaMAT基因的两个敲除型菌株(△MAT1和△M4T2)，通过表型实验初步比较了两个敲除菌株和野生菌株的生长速率、抗逆性及捕食线虫的能力，但MAT基因的生物学功能尚不明确。本文在对圆盘菌科真菌MAT基因结构深入分析的基础上，对加入秀丽隐杆线虫后A.oligospora野生型(Ao1和Ao2)和突变型菌株(△MAT1和△MAT2)的0h、12h、24h、36h的菌丝进行RNA-seq测序分析。最后对A.oligospora中受MAT基因调控的两个与有性生殖相关的功能基因PreB(AOL_s00075g223)和Asd（AOL_s00054g176)进行同源重组敲除，成功获得1个突变株△Asd,通过表型实验初步探究了Asd(AOL_s00054g176)的功能。研究结果如下: 1.圆盘菌科15株捕食线虫和非捕食线虫真菌MAT基因座分析 对圆盘菌科15株捕食线虫和非捕食线虫真菌MAT基因座预测分析，异宗配合捕食线虫真菌Drechslerellabrochopaga(YMF1.03216)的基因座最大，同宗配合非捕食线虫真菌Dicranidionsp.(YMF1.03024)的基因座最小。异宗配合非捕食线虫真菌Orbilialaevimarginata(YMF1.01833)的MAT1-1-1最大，同宗配合非捕食线虫真菌Orbiliasp.(YMF1.03507)的MAT1-1-1最小。MAT1-2-1最大的是异宗配合捕食线虫真菌A.oligospora(YMF1.02765),MAT1-2-1最小的是同宗配合非捕食线虫真菌Dicranidionsp.(YMF1.03024)。15株菌株MAT基因座结构中，所有圆盘菌科菌株中MAT基因座上游都存在两个紧密相连边界基因COX13和APN2,下游两个边界基因在菌株中不保守存在。两个同宗配合非捕食线虫物种Orbiliadorsalia(YMF1.01835)和Orbiliasp.(YMF1.01838)上MAT基因和保守边界基因位于不同contig上。 2.A.oligosporaMAT基因野生型菌株和突变株表型相关基因的RT-PCR结果 提取加入线虫后Ao1、Ao2、△MAT1和△MAT2的0h、12h、24h、36h的菌丝的RNA,逆转录成cDNA,挑选与表型相关的产孢基因、抗氧化基因、细胞壁合成基因，进行RT-PCR实验检测表达水平。在△MAT1中，受检测的10个产孢相关基因中有性生殖激活负调控因子NsdD（AOL_s00075g211)、无性生殖负调控因子VeA(AOL_s00169g18)发生下调以及分生孢子疏水蛋白RodA(AOL_s00006g570)、G蛋白信号转导调节因子FlbA(AOL_s00215g516)、分生孢子特异性蛋白AspB(AOL_s215g893)的表达水平上调是△MAT1产孢能力增加的原因。7个氧化胁迫有关的基因中硫氧还蛋白还原酶（AOL_s00054g257)转录水平发生显著下调造成△MAT1抗氧化能力下降。细胞壁合成基因中海藻糖合成酶(AOL_s00097g268)、几丁质合成酶(AOL_s00078g76)表达下调造成△MAT1细胞壁合成能力下降。在△MAT2中，性发育调节因子MedA(AOL_s00210g120）、调控分生孢子末期发育的转录因子AbaA(AOL_s00080g63)、产孢上游发育激活因子FlbC(AOL_s00007g157)表达下调以及无性生殖负调控因子VeA(AOL_s00169g18)的表达上调导致△MAT2产孢能力下降。氧化胁迫相关基因中谷胱甘肽还原酶(AOL_s00054g13)、硫氧还蛋白还原酶(AOL_s00054g257)基因转录表达水平上调，提高了△MAT2的抗氧化能力。细胞壁合成的相关基因中己糖激酶(AOL_s00112g89)、β-葡萄糖苷酶(AOL_s00083g375)、海藻糖合成酶(AOL_s00097g268)基因上调提高了△MAT2细胞壁合成能力。 3.A.oligosporaMAT基因野生型菌株和突变株的转录组分析 提取加入线虫后Ao1、Ao2、△MAT1和△MAT2的0h、12h、24h、36h的菌丝进行RNA-seq测序分析，使用R语言DEseq2包筛选出差异基因后，进行Venn基因集分析、GO和KEGG富集分析、次级代谢产物基因簇中差异基因的鉴定以及受MAT基因调控的有性生殖相关基因的筛选。分析结果发现在△MAT1和△MAT2中，很多参与A.oligospora调控三维菌网形成的通路被差异基因富集，包括MAPK信号通路、细胞色素P450代谢途径、cAMP信号通路以及AMPK信号等。在△MAT1和△MAT2中都发现6个次级代谢基因簇多达5个被MAT基因调控，并且大多数次级代谢产物基因簇上的基因都发生表达下调，结果表明A.oligosporaMAT基因调控菌株次级代谢生物过程。在DEGs中查找15个丝状真菌有性生殖相关基因的同源基因时，发现12个基因在A.oligospora中存在同源基因，且11个基因同时受到MAT1-1-1和MAT1-2-1基因的正调控，为后续探究MAT1-1-1和MAT1-2-1的调控通路奠定基础。 4.A.oligospora中受MAT基因调控的功能基因的敲除及功能分析 选取受MAT1-1-1和MAT1-2-1同时调控的信息素受体编码基因PreB（AOL_s00075g223)和调控子实体发育的基因Asd基因(AOL_s00054g176),成功构建了PreB和Asd的敲除载体，以A.oligospora(YMF1.01883MAT1-2-1)为敲除对象进行同源重组敲除，成功获得△Asd。对得到的△Asd进行表型实验分析:△Asd的产孢数量以及产捕器数量下降一半以上，在加入Nacl的培养基中△Asd生长快于野生型菌株。在加入SDS的培养基中野生型菌株生长速度快于△Asd。在加入不同浓度的H2O2培养基中，△Asd生长更快表现出很强的抗氧化能力。
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