摘要
研究背景: 胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)是一种由肠道L细胞分泌的30个氨基酸组成的多肽(7-37)。GLP-1(7-37)激活GLP-1受体(GLP-1receptor,GLP-1R)促进胰岛β细胞分泌胰岛素调控血糖。GLP-1(7-37)N端的两个氨基酸迅速被二肽基肽酶-4裂解，代谢为GLP-1(9-37)从而失去激活GLP-1R的作用。GLP-1药物目前用于治疗2型糖尿病和肥胖，对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)患者的肝脂肪变性、炎症等也有治疗作用。疗效归结于GLP-1药物直接的肝脏效应和减重的协同效应。临床前研究也显示，利拉鲁肽显著改善小鼠脂肪肝但不伴随体重改变，提示肝脏是GLP-1在胰岛外的靶器官之一。但是肝脏不表达GLP-1R,提示GLP-1的肝脏作用可能通过非经典GLP-1R通路。GLP-1(9-37)虽然没有促进胰岛素分泌的作用，但能不依赖于GLP-1R降低肝脏葡萄糖生成。因此本课题假设:GLP-1在肝脏中直接生物学作用是通过GLP-1(9-37)发挥的，GLP-1(9-37)通过一种尚未发现的新受体机制降低肝脏脂质堆积从而改善肝细胞糖脂代谢紊乱。 研究方法: 为了研究GLP-1(9-37)的生物功能，我们利用基因工程重组蛋白技术分别构建制作GLP-1(9-37)、GLP-1(7-37)与人源IgG2-Fc片段的融合蛋白9-37/Fc和7-37/Fc,用于后续荧光标记、抗IgG-Fc抗体检测和蛋白A珠纯化。我们通过以下实验检测9-37/Fc和7-37/Fc在体内的分布及其与肝脏结合情况:显微注射斑马鱼检测荧光标记的9-37/Fc和7-37/Fc在斑马鱼体内的分布;流式细胞术检测9-37/Fc和7-37/Fc与野生型和GLP-1R敲除小鼠原代肝细胞的结合;基于细胞ELISA的配体-受体结合试验检测9-37/Fc和7-37/Fc与HepG2细胞的结合亲和力。 为了研究9-37/Fc与肝细胞结合的生理学意义，我们在斑马鱼和小鼠体内注射9-37/Fc后检测肝脏糖异生的关键酶;我们同时建立预防高脂饮食诱导小鼠脂肪肝的模型，将C57BL/6雄性小鼠分为普通饮食(n=6)、高脂饮食(n=8)、高脂饮食+7-37/Fc(n=8,0.3μg/g,腹腔注射，每周2次)和高脂饮食+9-37/Fc(n=8,0.3μg/g,腹腔注射，每周2次)四组饲养12周。在治疗高脂饮食诱导小鼠脂肪肝的模型中，将C57BL/6雄性小鼠分为普通饮食(n=6)和高脂饮食(n=24)喂养12周后，高脂饮食组小鼠均分为三组，其中两组分别接受7-37/Fc(n=8)或9-37/Fc(n=8)干预4周。预防和治疗组小鼠每周监测体重和摄食量，在干预结束后进行IPGTT和IPITT检测，随后取血检测血脂、转氨酶水平以及血清中炎症因子IL-6和TNF-α的水平。我们进一步留取肝脏检测甘油三酯和胆固醇含量;HE和油红染色检测肝脏病理学变化和脂质沉积情况;通过ELISA试剂盒检测肝脏MDA含量，抗氧化酶GSH-Px和SOD活性;RT-qPCR和Westernblot检测肝脏IL-6和TNF-α的表达。在体外，我们使用棕榈酸处理HepG2细胞建立脂肪变性模型，给予9-37/Fc或7-37/Fc干预后，通过油红O染色及甘油三酯含量检测来观察各组细胞内脂质沉积情况。 为了研究9-37/Fc调控肝脏脂质代谢的机制，我们首先用蔗糖密度梯度离心分离大鼠肝细胞膜蛋白，用9-37/Fc进行pull-down实验，银染SDS-PAGE进行质谱分析鉴定9-37/Fc的潜在受体。我们将9-37/Fc与HepG2细胞在4℃下孵育4小时，然后换到37℃孵育5、15、30分钟，随后利用免疫荧光染色检测9-37/Fc的内吞作用，进一步通过和潜在受体进行免疫荧光共染来探究受体介导的9-37/Fc的内吞作用。为了明确潜在受体在9-37/Fc与HepG2细胞结合中的作用，我们通过siRNA或质粒转染技术敲低或过表达潜在受体来检测9-37/Fc与HepG2细胞的亲和力。在HepG2细胞过表达或敲低潜在受体情况下，检测9-37/Fc改善肝细胞脂质代谢的作用及机制。实验检测包括油红染色，甘油三酯含量，下游信号通路分子ERK的磷酸化水平以及脂质合成和分解相关基因的变化。 研究结果: 用荧光标记的7-37/Fc和9-37/Fc注射斑马鱼的结果显示，7-37/Fc主要分布在胰腺和胰岛，未见明显肝脏分布，而9-37/Fc主要分布在肝脏，部分在胰腺。用野生型和GLP-1R敲除小鼠的肝细胞进行流式细胞术实验显示,9-37/Fc与WT和GLP-1R敲除小鼠的肝细胞均有较强的特异结合，而7-37/Fc均未显示明显的结合。此外，9-37/Fc以浓度依赖的方式与HepG2细胞结合。与7-37/Fc相比，9-37/Fc与HepG2细胞结合的亲和力高近50倍。 免疫荧光和RT-qPCR结果显示，9-37/Fc而不是7-37/Fc显著降低了转基因斑马鱼糖异生关键酶PEPCK和G6PC基因表达。与斑马鱼的结果一致，9-37/Fc较7-37/Fc更显著降低了野生小鼠PEPCK和G6PC基因表达。油红染色和甘油三酯测定结果显示,9-37/Fc而不是7-37/Fc剂量依赖性地降低PA诱导HepG2细胞的脂质沉积。在预防和治疗高脂饮食诱导小鼠脂肪肝的模型中，7-37/Fc显著改善肝脂肪变性和炎症反应，并伴随着小鼠体重降低、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性改善。9-37/Fc在不改变小鼠体重和葡萄糖耐量情况下，显著改善了小鼠的血脂代谢紊乱、肝脂肪变性、肝脏氧化应激和炎症反应以及胰岛素敏感性。 质谱结果显示，9-37/Fc可能与长链脂酰辅酶A合成酶(ACSL1)结合。免疫荧光结果显示，ACSL1在肝细胞膜表面也有表达。进一步在HepG2细胞对质谱结果进行验证显示，在4℃条件下9-37/Fc(但不是7-37/Fc)与HepG2细胞有明显结合，在37℃30分钟条件下发生明显内吞。用ACSL1抗体进行免疫荧光共染的结果显示，9-37/Fc与ACSL1在细胞膜和细胞质内共定位，提示ACSL1介导9-37/Fc的内吞。9-37/Fc与HepG2细胞的结合力在敲低ACSL1后减弱，过表达ACSL1后增强，并且9-37/Fc降低PA诱导的HepG2细胞脂质堆积作用在敲低ACSL1后消失，过表达ACSL1后增强。ACSL1激活会抑制与其结合的二磷酸核苷激酶(NME)活性，从而激活p-ERK信号通路。我们进一步用Westernblot检测9-37/Fc对上述信号通路的影响。结果显示，9-37/Fc可以抑制ERK的磷酸化。9-37/Fc促进脂质分解相关基因的表达，降低脂质合成相关基因的表达。在敲低ACSL1后，9-37/Fc抑制ERK磷酸化和脂质合成、促进β氧化的作用消失，过表达后上述作用增强。 结论: GLP-1降低肝脏脂质堆积的作用主要通过GLP-1(9-37)发挥的。GLP-1(9-37)与肝细胞表面ACSL1结合内吞，并在胞内共定位，抑制下游ERK信号通路，继而促进脂质分解基因PPARα和CPT-1的表达并抑制脂质合成基因SREBP-1的表达，从而降低肝脏脂质堆积。
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