摘要
目的：川崎病（Kawasaki Disease, KD）是一种好发于5 岁以下婴幼儿、病因不明的、急性自限性血管炎性疾病，主要累及冠状动脉，可导致冠状动脉损伤,严重者可导致心肌缺血、心肌梗死，甚至猝死。目前KD 的发病原因及机制尚不完全清楚，既往研究表明，病原入侵所致的免疫失调是KD发病的关键因素，其中失控性炎症反应是KD免疫系统激活导致血管损伤的关键步骤。微小RNA-221（miR-221）是一种在血管内皮细胞和平滑肌细胞中高表达的非编码小分子RNA，可参与心血管疾病、炎症性疾病及类风湿性关节炎等多种疾病的发生。然而miR-221-3p在KD及其所致冠状动脉损失中的作用及机制尚不清楚。本研究在从真实世界的临床样本病例研究及体内外研究进一步阐明 miR-221-3p 在 KD 及冠状动脉损伤中的作用及机制，以期为 KD及其冠状动脉损伤提供新的治疗靶点。 第一部分 miR-221-3p在川崎病患儿血清中的表达水平及与冠状动脉损伤的关系 目的：探索急性期KD患儿血清中miR-221-3p的表达水平，阐述miR-221-3p与KD及KD所致冠状动脉损伤之间的潜在联系，分析miR-221-3p与KD患儿临床实验室指标之间的相关性。 方法：收集住院KD患儿急性期血清标本作为实验组（KD组），根据超声心动图检测结果,将其分为无冠状动脉损伤组（KD-NCALs）及冠状动脉损伤组（KD-CALs）,依据IVIG敏感性分为IVIG敏感组及IVIG抵抗组。选取同时期正常儿童血清标本作为正常对照组（HC组）。运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测KD组及HC组患儿血清中miR-221-3p的表达水平，分析miR-221-3p与急性期KD患儿一般临床实验室指标的相关性。分别计算IVIG敏感组及IVIG抵抗组中Kobayashi评分，采用ROC曲线下面积（AUC）评估miR-221-3p在预测KD患儿发生IVIG抵抗及冠状动脉损伤中的诊断价值。 结果：（1）本研究共纳入29名正常组儿童及55名KD组患儿，两组儿童的性别和年龄的差异无统计学意义。KD 急性期患儿血清中miR-221-3p 水平较正常组儿童明显升高（p＜ 0.05），与临床实验室指标中的炎症因子：N%、CRP、PCT以及NLR呈正相关，与L%呈负相关；同时，结果显示KD患儿急性期血清中的miR-221-3p与IVIG给药总量及IVIG 给药次数呈正相关（r = 0.501, p＜ 0.001; r = 0.558,p＜ 0.001），与发病年龄、性别无相关性（p均＞ 0.05）。 （2）与无冠状动脉损伤组（KD-NCALs，n=10）及IVIG敏感组(n=42)患儿相比，冠状动脉损伤组（KD-CALs，n=42）及IVIG抵抗组(n=13)患儿急性期外周血血清中的 miR-221-3p 的表达水平明显升高（p＜ 0.05）。同时结果显示，IVIG 抵抗组患儿的发热时间明显延长，其血液生化指标中的 MPV、PDW、ANC、TLB、ALT、AST、CRP、PCT、NLR及PT水平较IVIG敏感组明显升高，而ALC、PLT及ALB较IVIG敏感组明显降低。 （3）IVIG抵抗组的Kobayashi评分得分高于IVIG敏感组（p＜0.001），miR-221-3p及Kobayashi评分用于预测KD患儿发生IVIG耐药的ROC 曲线下面积（AUC）分别为0.811 （95% CI, 0.672-0.951） （p = 0.001）, 0.793 （95% CI, 0.618-0.968）（p = 0.002）；此外， miR-221-3p 用于预测冠状动脉损伤的 AUC 为 0.83 （95% CI, 0.648-1.000, p＜0.05）。 结论：miR-221-3p在KD急性期患儿血清中较正常组升高，且在冠状动脉损伤组及 IVIG 抵抗组中表达增加，相关性研究分析显示miR-221-3p与临床实验室炎症指标CRP、PCT、NLR等具有相关性，提示miR-221-3p可能通过调控炎症反应参与KD及其所致冠状动脉损伤以及IVIG抵抗的发生，同时miR-221-3p有望成为KD冠状动脉损伤及IVIG耐药的潜在生物学标志物及预测指标。 第二部分 基于生物信息学分析 miR-221-3p 的靶基因及其网络调控机制 目的：利用生物信息学分析方法预测 hsa-miR-221-3p 的靶基因及其靶基因的网络调控机制，为miR-221-3p在KD冠状动脉损伤中的作用机制提供潜在的理论基础。 方法：通过生物信息学方法，使用TargetScan，miRTarBase，miRDB三个在线数据库进行 hsa-miR-221-3p 的靶基因预测，采用韦恩分析得到预测的共同靶基因集。采用 cluster Profiler 软件对预测到的交集基因集进行基因本体（Go）功能注释分析及京都基因与基因组百科全书（KEEG）数据库通路分析。利用蛋白相互作用网络（PPI）得到miR-221-3p 交集基因集合的调控网络，通过 Cytoscape 软件寻找miR-221-3p 调控网络中的关键功能模块及关键基因（HUB 基因）,并对关键基因进行KEEG富集分析。 结果：（1）采用TargetScan，miRTarBase，miRDB三个在线miRNA靶基因预测数据库分别得到miR-221-3p预测的靶基因数为252个、485 个、616 个，对三个数据库预测到的靶基因进行韦恩分析发现与hsa-miR-221-3p存在结合位点的共同靶基因集，其中共有42个共同靶基因，约占预测靶基因总和的3.10%。 （2）GO功能注释分析发现，hsa-miR-221-3p的靶基因主要富集在微管相关复合物、核周内质网、核包涵体、端粒酶全酶复合物、磷脂酰肌醇3-激酶复合物及细胞质动力蛋白复合物等细胞组分，同时还参与了细胞粘附、细胞凋亡、DNA 损伤、蛋白质泛素化、RNA 聚合酶 Ⅱ 转录调控区特异性结合的调控等多种生物学过程和分子功能。KEEG 通路分析显示 hsa-miR-221-3p 主要富集在结直肠癌、细胞凋亡、催乳素及肿瘤坏死因子等信号通路中。 （3）基于hsa-miR-221-3p交集靶基因集合的PPI网络构建，通过Cytoscape软件寻找到了miR-221-3p调控通路中的2个关键功能模块及前10位HUB基因：FOS、CTCF、RNF4、BCL2L11、SOCS3、PIK3R1、DDIT4、DUSP16、PCDHA10、PCDHA7。通过对前 10 位HUB基因与KD相关性文献检索，发现miR-221-3p的HUB基因SOCS3可参与KD的发生。 结论：本研究通过对 hsa-miR-221-3p 的靶基因进行功能富集分析和信号转导通路富集分析发现，hsa-miR-221-3p主要参与了细胞粘附、细胞凋亡、DNA损伤、蛋白质泛素化等多种生物学过程，可通过调控细胞凋亡、TNF信号通路、JAK/STAT等信号通路参与癌症及炎症等疾病的发生。通过对前10位HUB基因与KD相关性文献检索，发现miR-221-3p的HUB基因SOCS3可参与KD的发生。因此，我们初步预测hsa-miR-221-3p可能通过调控SOCS3的表达介导血管炎症反应的发生，为进一步深入探讨miR-221-3p在KD及冠状动脉损伤中的作用及机制提供了潜在的理论基础。 第三部分 miR-221-3p 及 SOCS3在小鼠川崎病样冠状动脉炎模型中的表达情况 目的：探索miR-221-3p及SOCS3在小鼠川崎病样冠状动脉炎模型中的表达情况，探讨miR-221-3p及SOCS3与川崎病冠状动脉损伤的关系。 方法：利用白色念珠菌水溶性提取物（candida albicans water-soluble fraction，CAWS）腹腔注射构建小鼠川崎病样冠状动脉炎模型，采用HE染色方法，通过病理切片观察小鼠模型中主动脉瓣环及冠状动脉周围炎性细胞浸润情况，并采用主动脉炎和冠脉炎的方式进行小鼠血管炎评分。采用原位杂交方法检测has-miR-221-3p在小鼠川崎病样冠状动脉炎中的表达情况，运用免疫组织化学方法检测小鼠川崎病样冠状动脉炎模型中的IL-6及SOCS3的表达情况。 结果：（1）通过单次腹腔注射CAWS成功构建了模拟川崎病冠状动脉病理改变的小鼠川崎病样冠状动脉炎模型。通过HE染色病理切片阅片可见，与腹腔注射生理盐水小鼠（NS 组）相比，小鼠川崎病样冠状动脉炎模型组（CAWS组）中的冠状动脉病理切片可见冠状动脉血管内膜增生、官腔狭窄形成，增生的冠状动脉周围可见大量炎性细胞浸润。同时血管炎评分结果显示，与NS组小鼠相比，CAWS组小鼠血管炎指数明显增高（p＜0.05）。 （2）原位杂交结果显示 miR-221-3p 在 CAWS 组小鼠的冠状动脉组织中表达明显增加，阅片显示 miR-221-3p 主要在细胞胞浆中表达，且分布沿增生的冠状动脉及主动脉瓣环分布，且以炎性细胞浸润的血管中膜层明显。 结论：本部分研究结果显示miR-221-3p及IL-6在CAWS构建的小鼠川崎病样冠状动脉炎模型中的表达明显增加，且以炎症细胞浸润的中膜层为主，而miR-221-3p的预测靶基因SOCS3在CAWS组小鼠冠状动脉中的表达明显减少，提示 miR-221-3p/SOCS3 轴可能参与了KD冠状动脉损伤的发生。
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