摘要
目的 阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）对患者、照料者及公共卫生系统造成了严重负担。神经元丢失在AD疾病早期即可出现，随着病情进展逐渐加重。细胞凋亡是导致 AD 患者神经元丢失的最主要原因，贯穿AD病理进程始终，随着疾病进展逐渐加重。本课题前期通过生物信息学分析发现AD患者脑内SIRT4表达较同龄对照组增高，在AD 动物模型及细胞模型中均发现类似趋势。SIRT4 为线粒体 sirtuins之一，与葡萄糖、胰岛素、脂质代谢及能量代谢密切相关，在既往对其他疾病的研究中被报道参与了细胞凋亡。本研究的主要研究目标是明确SIRT4是否在AD病理的进程中发挥相应作用，以及是否通过影响神经元凋亡来发挥作用。 方法 第一部分：采用经典的 APP/PS1小鼠为AD动物模型，以Aβ处理的HT-22细胞为AD细胞模型。采用qPCR法、WB法及免疫荧光法分析SIRT4在疾病组与对照组的表达差异。随后构建了sh-SIRT4慢病毒对 APP/PS1 小鼠和 HT-22 小鼠海马神经元细胞系进行转染。SIRT4敲低的动物和细胞模型建立后，采用免疫组织化学法分析各组小鼠Aβ沉积之间差异；采用水迷宫实验和旷场实验对各组小鼠的学习和记忆力、焦虑情绪和运动情况进行比较；采用 WB 法、流式细胞术检测各组小鼠海马组织及细胞模型中的细胞凋亡情况。 第二部分：采用 WB 法分析动物和细胞模型中对照组、模型组、模型+SIRT4敲低组以及模型+对照病毒组的mTOR通路相关蛋白的表达情况。 第三部分：在UCSC数据库中分析可能与SIRT4基因启动子序列结合的转录因子STAT2；采用qPCR法分析转录因子STAT2在疾病和对照组之间的表达差异；采用 WB 法进一步验证转录因子 STAT2 对SIRT4、mTOR通路蛋白、细胞凋亡相关分子的调控。在明确STAT2对SIRT4及其下游通路、细胞凋亡的影响基础上，采用双荧光素酶报告基因实验明确转录因子 STAT2 与 SIRT4 基因启动子的结合区域。采用JASPAR数据库预测STAT2与SIRT4基因结合的位点，采用CHIP-qPCR实验验证二者的结合位点。 结果 第一部分：SIRT4 mRNA及SIRT4蛋白在APP/PS1小鼠海马组织中表达较对照组增高。免疫组化实验显示，在APP/PS1小鼠海马区域敲低SIRT4可以减少APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积和记忆障碍。WB实验结果提示，SIRT4促进AD动物模型和AD细胞模型中的促凋亡蛋白表达，减少凋亡抑制因子BCL2的表达，提示SIRT4具有促凋亡效应。 第二部分：mTOR通路活性在APP/PS1小鼠海马和Aβ处理的HT-22细胞中表达较对照组小鼠和对照组细胞明显降低。进一步比较SIRT4敲低和未敲低的 APP/PS1 小鼠海马组织以及 Aβ 处理和未处理的 HT-22细胞中mTOR通路蛋白的表达水平发现，SIRT4敲低组较未敲低组mTOR 通路活性增高，细胞凋亡减少。回复实验提示 SIRT4通过改变mTOR通路活性促进细胞凋亡。 第三部分：STAT2 mRNA在APP/PS1小鼠海马组织和Aβ处理的HT-22细胞中表达降低。进一步验证SIRT4、mTOR通路相关蛋白和凋亡相关分子在STAT2敲低和未敲低的AD细胞模型中的表达情况，结果显示，与未敲低组相比，STAT2敲低组SIRT4表达进一步增高，mTOR通路活性进一步降低，bax、cleaved-caspase 3表达增高，bcl2表达进一步降低，提示STAT2具有抑制SIRT4、促进mTOR通路活性、抑制细胞凋亡的作用。回复实验提示，STAT2对mTOR通路和细胞凋亡的调控通过SIRT4实现，STAT2对细胞凋亡的调控是通过mTOR通路来实现的。采用双荧光素酶验证STAT2对SIRT4的转录调控作用，结果显示，STAT2可以与SIRT4基因转录起始位点上游1392 bp ~1965 bp启动子区域结合并抑制 SIRT4 基因转录，采用 CHIP-qPCR 实验提示， SIRT4基因转录起始位点上游 1713bp ~1725bp 处序列可在CHIP产物中被扩增出来，提示该区域为STAT2在SIRT4基因启动子区域的结合位点。 结论 SIRT4在AD病理进程中高表达，SIRT4通过加重神经元凋亡促进Aβ沉积和AD小鼠学习和记忆障碍。SIRT4在AD病理中的这一作用受到上游转录因子STAT2调控，并通过改变其下游的mTOR通路活性来实现。本研究提示SIRT4可以作为AD治疗的新靶点，为AD治疗选择提供了新的信息。
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