摘要
第一部分前瞻性队列:无创诊断工具在预测慢性乙型病毒性肝炎患者肝纤维化中的效果评价及探索 背景与目的: 肝脏硬度(LiverStiffness,LS)值及若干血清学指标可反映初治慢性乙型肝炎(ChronicHepatitisB,CHB)患者的肝纤维化程度。本研究旨在进一步评估上述无创诊断模型在CHB患者长期抗病毒治疗中的临床应用价值。 方法: 对2013年7月至2014年12月入组的接受口服抗病毒药物治疗的75例CHB队列开展前瞻性研究，随访416周。所有患者每26周监测LSM和血清学指标。基线时27例CHB患者进行肝脏活检，在恩替卡韦治疗后第78周及第260周时，分别有14及13例患者再次进行配对肝脏活检，并与相应时间点的无创诊断指标进行比较。 结果: 1、CHB基线肝脏穿刺活检患者的肝纤维化分期S2、S3、S4的LS值间存在显著差异(P＜0.01)，LS值随肝纤维化程度增加而升高。进展期纤维化(S≥3)时，LS值的ROC曲线下面积(AreaUndertheROCcurve,AUROC)表示的诊断准确性为0.84(95％CI:67.77％～99.51％)，最佳截断值为8.8kPa,此时敏感度为0.722,特异度为0.889。而肝硬化(S=4)时AUROC为0.82(95％CI:64.06％～100.22％),最佳截断值为12.4kPa,敏感度为0.571,特异度为0.950。 2、CHB治疗队列每26周、共17次的随访数据表明身体质量指数(BodyMassIndex,BMI)、血小板计数(PlateletCount,PLT)、白蛋白(Albumin,ALB)、丙氨酸氨基转移酶(AlanineAminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AspartateAminotransferase，AST)、γ-谷氨酰转肽酶(Gamma-GlutamylTranspeptidase，GGT)、胆碱酯酶(Cholinesterase，CHE)、国际标准化值(InternationalNormalizedRatio,INR)、凝血酶原时间(ProthrombinTime,PT)、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HepatitisBVirusDNA，HBV-DNA)、终末期肝病模型（ModelforEnd-stageLiverDisease,MELD评分、天冬氨酸氨基转移酶-血小板比率指数（Aspartateaminotransferase-to-plateletratioindex，APRI）、年龄-国际标准化值-白蛋白-γ-谷氨酰转肽酶指数（AIAG）、LS值均随治疗时间延长发生显著改变（P＜0.05），尤以ALB、ALT、AST、GGT、INR、PT、HBV-DNA改变更为明显（P＜0.01）。自抗病毒治疗第26周起，患者体内HBV-DNA定量明显低于治疗前（P＜0.001），而几乎所有患者在52周后体内病毒DNA量均低于检测下限。 3、抗病毒治疗随访第0.5、1、3、5、7年（即第26、52、156、260、364周）为节点，大幅下降的指标有AST、ALT、GGT和APRI;总体趋势显著升高的指标有PLT、ALB和CHE;而INR、PT、MELD评分和AIAG的总体趋势为前5年先显著降低，又于末2年显著升高。 4、CHB患者在416周的随访中，LS值逐渐下降，且LS值在ALT正常化后继续下降，但下降幅度逐渐减缓，并于第3年起有一定反复。治疗1年后，每26周随访时测得LS值与末次随访时数值均无显著变化，特别是肝脏活检CHB患者，前2次肝穿节点间LS值水平显著降低（P＜0.01），但第3次与第2次肝穿时间点LS值水平差别不明显（P=0.36）。随访第7年（第364周），有91.3％的患者实现了LS值的改善，而69.6％的患者比基线时的LS值降低了30％以上。多变量线性回归分析表明，LS值降低的程度与基线LS值和HBV-DNA定量的基线水平显著相关。 结论: 1、CHB患者中LS值与肝纤维化程度正相关，且对进展期纤维化（S≥3）和肝硬化（S=4）有较高诊断价值。 2、恩替卡韦治疗可促使CHB患者LS值逐渐降低，并促使ALT正常化后继续降低，但在第3年起有一定回升。CHB患者基线LS值和HBV-DNA定量水平越高，抗病毒治疗对LS值的改善越明显。 3、LS值的显著降低可能是CHB患者长期抗病毒治疗期间组织学纤维化消退的潜在无创预测指标，但需要进一步的大样本研究进行验证。 第二部分基于肝脏血流动力学变化的肝纤维化无创诊断新模型的构建及在慢性乙型病毒性肝炎患者中的验证 背景与目的: 当前肝纤维化无创诊断模型构建存在一定理论缺陷，现有肝纤维化无创诊断模型的构建大多基于胶原等纤维化发生环节，忽视了肝脏血流动力学变化，而肝窦毛细血管化、血管新生是肝纤维化发生发展的重要因素。同时，现有的检测措施包括血清生化评估、弹性成像、磁共振成像(MagneticResonanceImaging,MRI)等，尚不能够精准预测肝纤维化分期，且受临床症状、技术难度繁琐、价格等因素影响。本研究拟将物理学与生物医学融合，构建可准确描述肝脏血流与肝纤维化关系的无创诊断新模型，并利用临床数据进行训练和验证。 方法: 1、将肝小叶简化为六边形结构的生物模型，设毒素以像素剂的形式进入肝小叶，利用像素扩散(Pixel-Diffusion)模型描述毒素在肝内经血管扩散导致细胞死亡的动力学过程。得到方程:?C/?t=D(?2C/?x2+?2C/?y2)-γC。(其中C为毒素浓度，D为扩散系数，γ为衰减系数)。使用MATLAB计算微偏分方程完成1000次模拟，并以早先使用毒素诱导肝损伤后的真实肝活检图像验证其效果。 2、根据Pixel-diffusion模型结果，可推导串珠弹簧(Bead-Spring)模型的结构，以复杂弹簧来模拟肝组织的刚度。我们设基于毒素浓度的综合刚度系数为:fc=np-nf/npf+nf/npffiber（其中np为某一区域的内的总像素点，nf为纤维像素数，f为弹簧的原始刚度系数，ffiber为分布在肝小叶边缘的纤维抽象而成的纤维弹簧的刚度系数)。设复合弹簧网络由组织弹簧和纤维弹簧的组合共同构成，复合弹簧网络的弹性系数为:kspring=kfiber+ktissue/kfiber+ktissue(其中kspring是复合弹簧的弹性系数，ktissue是组织弹簧的弹性系数，kfiber是纤维弹簧的弹性系数)。通过计算结构的杨氏模量来测量肝组织的弹性刚度。在10个水平的外力作用下进行受力应变分析，分别进行30、60、300和1000次纤维随机生长的模拟，遵循METAVIR系统对模型中肝纤维化的状态进行分期，总结各分期杨氏模量均值。 3、假设肝脏血管中膜每个平滑肌细胞都在做上下方向的简谐运动。基于Pixel-Diffusion模型，不考虑降低能量的阻尼效应，沿血管壁各点的运动方程可描述为:m(x)+kx=0(其中m是各点的质量，k是平滑肌的弹性系数，x是各点的位移）。解运动方程后，得x（t）=Acos（ωt+φ）,ω=√k/m。肝纤维化状态下纤维网络包裹静脉，此时ωfibrosis=√kfibrosis/m。 应用多普勒超声全面采集肝内血管血流信息图谱（包括门静脉及肝静脉），利用超声组学的方法收集图谱中的参数。将时间信号进行傅里叶变化到频率，(f)（ζ）=∫∞-∞f(t）e-2πitζdt,（其中ξ为频率，t为时间），得到用来反映血液动力学和肝脏组织物理性质之间的关系的新算法。 4、前瞻性纳入2019年6月至2021年12月在复旦大学附属中山医院和石家庄第五人民医院就诊的157例CHB患者。对每例患者的肝脏多普勒超声图像进行血流动力学波形特征提取、特征分析和计算预测，使用R软件拟合统计，构建一个可对肝纤维化的程度进行无创诊断的新模型。最后，对新检测模型进行内部验证。 结果: 1、由纤维化生长模型——Pixel-Diffusion模型模拟的纤维化进程与早先实验中使用毒素诱导肝损伤后得到的真实肝纤维化活检样本组织学形态相符，能反映毒素影响下肝细胞死亡和纤维沉积的过程。 2、利用由此推导得到的肝脏组织力学模型——Bead-Spring模型，可模拟不同阶段肝纤维化的肝组织。受力应变分析表明随着肝内纤维沉积量的增加，组织的有效杨氏模量增加，且单位时间内杨氏模量与毒素浓度阈值成正比。遵循METAVIR系统对模型中肝纤维化的状态进行分期，发现肝硬化时刚度变异性较小易于测量;早期阶段（F1和F2）与之相反。 3、由基于Bead-Spring模型构建的血流动力学物理模型可得出纤维化时肝血管的振荡频率高于正常状态。由此推测静脉中的血液流动的振荡特征也与血管壁的弹性有关，且门静脉与肝静脉血流的差异可能反映肝纤维化的程度。由多普勒超声图像中得到的血流频率波形的偏移可反映纤维化对肝血流动力学的改变，比较血流进出点在超声图像中的峰值，每个峰值的差异对应肝纤维化的等级。该算法构建了血液动力学和肝脏组织的物理性质的关系。 4、经过逐步构建肝纤维化物理学模型及血流动力学物理学模型，最终建模训练得到新的肝纤维化无创诊断模型——肝脏血流动力学（BloodDynamicWave,BDW）模型，可用来分析肝脏病人的多普勒超声信息。内部验证结果显示:该模型诊断肝硬化（F4期）的AUROC为0.947,其诊断进展期肝纤维化（≥F3期）的AUROC为0.943,而诊断显著性肝纤维化（≥F2期）的AUROC为0.944。 结论: 1、利用Pixel-Diffusion模型和Bead-Spring模型可以有效模拟毒素诱导下的肝纤维化进程，确定肝纤维化过程中物理性质的变化，因此可用来测试关于肝纤维化进程和物理性质的假设。肝纤维化早期检测的准确性较低，而肝硬化时准确性较高。 2、基于Bead-Spring模型可得到血流动力学物理模型。该模型构建了血液动力学和肝脏组织的物理性质的关系，可用来分析肝病患者的多普勒超声信息，并利用血液动力学分析构建一种新的无创肝纤维化诊断工具。 3、BDW模型可用于临床无创诊断肝纤维化。经内部验证，该模型能精确预测肝纤维化分期，优于血清学模型FIB-4。不同分期中，BDW模型诊断肝硬化(F4期)的准确性最高。更准确的效果评估有待大样本量队列的进一步外部验证。 第三部分回顾性及前瞻性队列:无创诊断工具在筛查慢性乙型病毒性肝炎患者高危静脉曲张和临床显著门静脉高压中的效果评价及探索 背景与目的: 肝硬化门静脉高压(PortalHypertension，PH)食管胃底静脉曲张破裂出血危害大，造成巨大社会与经济负担。内镜是目前食管胃底静脉曲张诊断、分级和随访的“金标准”，但作为侵入性检查，不仅会有不适感，还存在包括麻醉并发症、穿孔风险、出血和费用高等缺点。而肝静脉压力梯度(HepaticVenousPressureGradient,HVPG)测量是目前领域内公认的评价肝病患者PH的“金标准”，但同样其有创性及技术要求限制了它的广泛应用。因此，开发一种无创、经济有效、易于操作的检查方法有助于其筛查和随访。 本研究拟评估现有血清学和弹性成像相关模型分别对预测高危静脉曲张(High-RiskVarices,HRV)和临床显著门静脉高压(ClinicallySignificantPortalHypertension,CSPH)的价值，并构建新的诊断模型予以验证，探讨新的无创筛查策略，以期减少不必要的侵入性检查。 方法: 1、回顾性队列纳入复旦大学附属中山医院2014-2021年就诊于我院消化科肝炎门诊及超声科门诊并接受过FibroScan肝脏弹性成像检查和胃镜检查的CHB代偿期进展性慢性肝病(CompensatedAdvancedChronicLiverDisease,cACLD)患者180例，收集一般临床资料、胃镜、HVPG值、LS值和血清学指标等结果。 2、前瞻性队列纳入26例于2021年9月至2023年1月入住我院消化内科病房，并于12个月内做过胃镜，诊断为肝硬化伴有食管胃底静脉曲张的患者。对其收集临床资料、HVPG值和血清学指标等结果，并行肝脏弹性成像检查。 3、根据内镜结果，所有患者被分为有或无HRV组。采用ROC曲线计算敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、AUROC,对于当前各诊断模型的准确性进行比较。对206例CHB患者的常规血清学指标、LS值、HVPG值与内镜证实的HRV之间的相关性进行单因素、多因素分析，通过logistic回归向前法拟合新的HRV诊断模型。随机抽取150例作为内部验证组，分别在训练组和验证组对新模型和前文各试验进行诊断效果比较。 4、在可获取HVPG值的72例患者中，根据HVPG结果被分为有或无CSPH组。同样采用ROC曲线计算敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、AUROC，对于当前各诊断模型的准确性进行比较。通过logistic回归向前法对72例CHB患者的常规血清学指标、LS值与HVPG值证实的CSPH之间的相关性进行单因素、多因素分析，拟合新的CSPH诊断模型。随机抽取25例作为内部验证组，分别在训练组和验证组比较新模型和前文各试验的诊断价值。 结果: 1、回顾性及前瞻性队列206例患者中，HRV组患者76例，非HRV患者130例;获取HVPG结果者72例，其中CSPH患者54例，非CSPH患者18例。 2、诊断和排除HRV的准确性方面: (1)现有评估指标和模型的表现为:FIB-4对应的AUROC值为0.716(95％CI:64.56％～78.61％)，为其中表现最佳，但诊断价值亦不高。其中表现最差为FI(AUROC=0.612)。 (2)基于BAVENOⅦ指南意见的BAVENOⅥ标准(AUROC=0.61，敏感度0.93，特异度0.28)和扩展BAVENOⅥ标准(AUROC=0.67，敏感度0.87,特异度0.47)均未达到FIB-4的表现。 3、诊断和排除CSPH的准确性方面: (1)现有评估指标和模型的表现为:AIAG对应的AUROC值为0.70(95％CI:0.57～0.83)，表现最佳，但诊断价值亦不高。其他9个模型的AUROC均＜0.7,诊断价值不佳，其中最低为AAR和GPR。 (2)基于BAVENOⅦ指南意见的CSPH-EXCLUDE模型(AUROC=0.53,敏感度1，特异度0.06)和CSPH-ASSUME模型(AUROC=0.66,敏感度0.48,特异度0.83)均未达到AIAG的表现。 4、HRV组具有显著更高的LS值(P=0.025)，中位LS值为18.95kPa。有或无HRV的两组间，ALP(P=0.035)、INR(P=0.000)、PT(P=0.000)、APTT(P=0.003)、PLT(P=0.000)、ALB(P=0.018)、ALT(P=0.018)、RBC(P=0.001)、HB(P=0.001)有统计学差异。通过Logistic回归向前法对上述有统计学差异的指标进行多因素分析，显示PLT、ALT、ALP和APTT指标为CHB-cACLD患者发生HRV的独立危险因素。 以此为基础，构建PAAA预测模型:PAAA=e^p0/(1+e^p0);p0=-2.085-0.013*PLT-0.012*ALT+0.004*ALP+0.100*APTT。该模型在训练组中AUROC=0.77,敏感度0.8，特异度0.65,最佳截断值为0.46;在内部验证组中AUROC=0.75,敏感度0.77,特异度0.66,最佳截断值为0.43。 PAAA预测模型在训练组和验证组中的AUROC均高于前文中现有无创诊断模型的表现。 5、CSPH组具有显著更高的LS值(P=0.001)，中位LS值为24.30kPa。在有或无CSPH的两组间，TB(P=0.022)、层粘连蛋白(P=0.008)和Ⅳ型胶原水平(P=0.013)有统计学差异。 通过logistic回归向前法对上述有统计学差异的指标进行多因素分析，显示层粘连蛋白指标为CHB-cACLD患者发生CSPH的独立危险因素，构建层粘连蛋白相关模型:层粘连蛋白相关模型=e^p0/(1+e^p0);P1=-1.019+0.022*层粘连蛋白。该模型在训练组中AUROC=0.76,敏感度0.71，特异度0.75,最佳截断值为0.46;在内部验证组中AUROC=0.79,敏感度0.78,特异度0.86,最佳截断值为0.63。 层粘连蛋白相关模型在训练组和验证组中的AUROC均高于前文现有无创诊断模型的表现。 结论: 1、血清学指标PLT、ALT、ALP和APTT是CHB-cACLD患者发生HRV的独立危险因素，由此构建的PAAA评分模型可对预测HRV有较好诊断价值。 2、层粘连蛋白是CHB-cACLD患者发生CSPH的独立危险因素，基于此构建的层粘连蛋白相关模型可对预测CSPH有较好诊断价值。 3、PAAA预测模型和层粘连蛋白相关模型在本研究的训练组和内部验证组在预测HRV和CSPH方面优于现有无创诊断模型，有助于辅助临床肝硬化患者的静脉曲张和门静脉高压病情程度的判断和指导诊疗，避免不必要的侵入性检查。但有待进一步更大样本量的外部验证。
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