摘要
研究表明导致神经元死亡是吸入麻醉药诱导发育脑神经毒性的主要特征，但具体机制不清。铁死亡（ferroptosis）是细胞程序性死亡的一种形式。研究证实，铁死亡不仅介导心脏、肝脏和肾脏等器官损伤的细胞死亡过程，还与多种神经疾病的细胞死亡相关。目前，七氟烷能否诱导发育脑神经元铁死亡仍未明确。内质网应激介导的ATF3活化在七氟烷诱导的发育脑神经元铁死亡过程中作用如何，其调控细胞内铁离子稳态失衡的机制是什么，以及脂质过氧化损伤级联通过什么途径被激活尚不清楚。 研究目的： （1）探究七氟烷能否诱导发育脑神经元铁死亡。 （2）探究内质网应激介导的ATF3活化在七氟烷诱导发育脑铁死亡过程中可能的作用机制，为吸入麻醉药的神经发育毒性作用提供一种潜在的防治策略。 研究方法： （1）HT22小鼠海马神经元细胞和大鼠原代海马神经元分别给予2%、4%、8%七氟烷处理6 h、12 h、24 h后，采用MTT法检测细胞的活力，LDH释放实验检测细胞的死亡率，应用铁离子和丙二醛（MDA）检测试剂盒检测神经元细胞内Fe2+浓度和MDA含量，应用光学显微镜观察神经元细胞的形态变化，应用透射电镜观察神经元细胞线粒体形态的变化，应用蛋白印迹法检测神经元细胞内铁离子代谢相关蛋白包括转铁蛋白受体（TFR）、转铁蛋白（TF）和铁转运蛋白（FPN）的表达。神经元细胞分别给予铁螯合剂去铁胺（DFO）（100μmol/L），抗氧化剂Fer-1（50μmol/L）、Lip-1（10μmol/L）、Vit E（100μmol/L）、GSH（2.5 mmol/L）或等量生理盐水预处理1 h，然后分别给予4%、8%七氟烷处理24 h后，检测细胞的生存率和死亡率及神经元细胞内Fe2+浓度和MDA含量。 （2）HT22小鼠海马神经元细胞和大鼠原代海马神经元分别给予4%、8%七氟烷处理6~24 h，应用H2O2试剂盒检测神经元细胞内H2O2含量。神经元细胞分别给予GSH（2.5 mmol/L）或生理盐水预处理1 h，然后给予七氟烷处理，应用铁离子和过氧化氢试剂盒检测神经元细胞内Fe2+浓度和H2O2含量，应用蛋白印迹法检测神经元细胞内TFR、TF和FPN的表达。神经元细胞给予H2O2（500μmol/L）处理24 h后，检测神经元细胞内死亡率、神经元细胞内Fe2+浓度和MDA含量及TFR、TF和FPN的表达。 （3）HT22小鼠海马神经元细胞和大鼠原代海马神经元给予4%、8%七氟烷处理6~24 h后，应用蛋白印迹法检测神经元细胞内ATF3的表达，应用共聚焦显微镜检测神经元细胞核内ATF3的聚集。神经元细胞应用siRNA沉默ATF3基因，再给予8%七氟烷处理24 h后，检测细胞的死亡率，应用铁离子、过氧化氢和MDA试剂盒检测神经元细胞内Fe2+、H2O2和MDA含量，应用蛋白印迹法检测神经元细胞内TFR、TF和FPN的表达。 （4）HT22小鼠海马神经元细胞和大鼠原代海马神经元分别给予4%、8%七氟烷处理6~24 h后，应用蛋白印迹法检测神经元细胞内质网应激相关蛋白GRP78、PERK和ATF4的表达。神经元细胞给予内质网应激抑制剂4-PBA（250μmol/L）、PERK抑制剂GSK2606414（1μmol/L）或生理盐水预处理1 h，然后给予8%七氟烷处理24 h后，检测细胞的死亡率，应用铁离子、过氧化氢和MDA试剂盒检测神经元细胞内Fe2+、H2O2和MDA含量，应用蛋白印迹法检测神经元细胞GRP78、PERK、ATF4、ATF3、TFR、TF和FPN的表达。神经元细胞应用siRNA沉默ATF4基因，再给予8%七氟烷处理24 h后，检测细胞的死亡率，神经元细胞内Fe2+浓度、H2O2和MDA含量及ATF4、ATF3、TFR、TF和FPN的表达。 （5）HT22小鼠海马神经元细胞分别给予4%、8%七氟烷处理24 h后，应用超氧化物阴离子荧光探针二氢乙锭（DHE）检测神经元细胞内超氧化物水平变化。神经元细胞给予4%、8%七氟烷处理6~24 h后，应用蛋白印迹法检测神经元细胞内NADPH氧化酶4（NOX4）、过氧化氢酶（Catalase）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和胱氨酸/谷氨酸转运体轻链亚基（SLC7A11）的表达。神经元细胞给予NOX4抑制剂GKT137831（50μmol/L）或生理盐水预处理1 h，然后给予8%七氟烷处理24 h，应用DHE法检测神经元细胞内超氧化物水平变化，应用铁离子、过氧化氢和MDA试剂盒检测神经元细胞内Fe2+浓度、H2O2和MDA含量，应用蛋白印迹法检测神经元细胞内NOX4、TFR、TF和FPN的表达。神经元细胞应用siRNA沉默ATF3基因，给予8%七氟烷24 h后，检测神经元细胞内NOX4、Catalase、GPX4和SLC7A11的表达，应用半胱氨酸和谷胱甘肽（GSH）试剂盒检测神经元细胞内半胱氨酸和GSH的含量。 研究结果： （1）七氟烷暴露能够浓度和时间依赖性地抑制海马神经元细胞活力和诱导神经元细胞死亡，引起神经元细胞内Fe2+浓度和MDA含量显著增加及TFR和TF表达上调和FPN表达下调。光学显微镜观察神经元细胞暴露于8%七氟烷24小时后，神经元细胞密度下降、体积变小，轮廓变圆。透射电镜观察到七氟烷暴露后神经元细胞内线粒体皱缩，膜密度增加，嵴扩张，这符合铁死亡的形态学特征。给予铁螯合剂DFO能够明显抑制七氟烷诱导的神经元细胞死亡，减少七氟烷暴露后神经元细胞内Fe2+浓度和MDA含量的增加。此外，应用脂质抑制剂Fer-1和Lip-1预处理显著抑制七氟烷诱导的神经元细胞内MDA增加，同时减轻七氟烷对神经元细胞的致死作用。 （2）七氟烷暴露能够浓度和时间依赖性地诱导神经元细胞内H2O2的增加。给予GSH预处理减少H2O2的生成，不仅能够明显抑制七氟烷诱导的神经元细胞内Fe2+、MDA的增加和神经元细胞死亡，同时还能阻断七氟烷诱导的神经元细胞内TFR、TF的上调和FPN的下调。此外，给予外源性H2O2能够诱导神经元细胞内Fe2+、MDA的增加和神经元细胞死亡，促进TFR、TF的上调和FPN的下调。 （3）七氟烷暴露能够浓度和时间依赖性地诱导神经元细胞内ATF3的表达增加，促进ATF3的核转位。激光共聚焦显微镜观察到七氟烷暴露后神经元细胞核内ATF3明显积聚。沉默ATF3基因不仅能够抑制了七氟烷诱导的神经元细胞内H2O2、Fe2+、MDA含量的增加和神经元细胞死亡，还能阻断七氟烷诱导的神经元细胞内TFR和TF的上调和FPN的下调。 （4）七氟烷暴露能够浓度和时间依赖性地诱导神经元细胞中内质网应激相关蛋白GRP78、PERK和ATF4的表达。给予内质网应激抑制剂4-PBA或PERK抑制剂GSK2606414干预不仅能够抑制七氟烷诱导的神经元细胞内GRP78、PERK、ATF4上调和神经元细胞死亡，还能抑制七氟烷诱导的神经元细胞内ATF3的表达，同时减少七氟烷诱导的神经元细胞内H2O2、Fe2+、MDA增加以及TFR、TF上调和FPN下调。此外，沉默ATF4基因能够明显抑制七氟烷诱导的神经元细胞内ATF3表达和神经元细胞死亡，同时减少七氟烷诱导的神经元细胞内H2O2、Fe2+、MDA增加以及TFR、TF上调和FPN下调。 （5）七氟烷暴露能够浓度和时间依赖性地诱导神经元细胞内超氧阴离子增加、NOX4表达上调及Catalase、GPX4和SLC7A11表达下调。给予GKT137831抑制NOX4的表达能够显著减少七氟烷诱导的神经元细胞内超氧阴离子和H2O2增加，同时抑制七氟烷诱导的神经元细胞内Fe2+和MDA增加及TFR、TF上调和FPN下调。此外，沉默ATF3基因能够明显抑制七氟烷诱导神经元细胞内NOX4上调及Catalase、GPX4和SLC7A11下调，同时减少七氟烷诱导的神经元细胞内Cysteine和GSH含量下降。 研究结论： （1）体内和体外研究表明，临床浓度相关的七氟烷暴露能够导致发育期大脑海马神经元铁死亡，其机制与神经元细胞内Fe2+浓度增加和脂质过氧化有关。 （2）七氟烷暴露能够通过诱导内质网应激引起PREK/ATF4通路活化，导致ATF3活化和核转位，进而引起神经元细胞内H2O2积聚。过量的H2O2直接与Fe2+通过芬顿反应生成羟基自由基，进而对细胞膜PUFA产生脂质过氧化损伤，同时H2O2还能够诱导神经元细胞内TFR、TF表达上调和FPN表达下调，进一步增加神经元细胞内Fe2+，导致持续的脂质过氧化损伤积累，启动铁死亡级联过程，最终导致海马神经元铁死亡。 （3）七氟烷诱导的ATF3活化导致神经元细胞内H2O2增加的机制是：ATF3一方面通过上调NOX4表达和抑制Catalase表达促进神经元细胞内H2O2增加，另一方面通过抑制GPX4和SLC7A11表达，引起神经元细胞内半胱氨酸和GSH下降，进而导致H2O2清除能力下降。 （4）七氟烷重复暴露能够通过诱导新生小鼠海马神经元内质网应激ATF3活化，引起海马神经元铁死亡，进而导致新生小鼠空间学习记忆损伤。
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