摘要
微藻利用葡萄糖进行异养培养具有高效高密度和不受自然环境影响的优势，有助于解决微藻生物质大规模工厂化稳定生产问题。但自然界中绝大多数微藻不能利用葡萄糖进行异养培养。葡萄糖转运体是微藻用于吸收胞外葡萄糖的通道，细胞膜葡萄糖转运体的缺乏是光合微藻不能进行异养生长的主要原因。因此通过基因工程的方法将外源葡萄糖转运体基因转化到微藻中是实现微藻异养改造的首要条件。莱茵衣藻和雨生红球藻是重要的单细胞真核光合微藻。本研究以莱茵衣藻和雨生红球藻为研究对象，研究葡萄糖转运体的遗传转化，成功转入了 3种葡萄糖转运体基因，获得了可吸收胞外葡萄糖进行兼养培养的转化株。研究结果为这两种微藻进行异养改造奠定了可行性基础。取得的主要成果如下: 1.解析了莱茵衣藻和雨生红球藻不能利用葡萄糖进行异养生长的原因。 经添加D-Glucose-U-13C在不同培养条件下进行培养，发现两种微藻在兼养和异养条件下中间代谢产物中13C的比例都高于自然水平，但都不高于20％,兼养条件下同位素异数体以低标记组分为主，吸收的胞外葡萄糖对于细胞代谢的碳流贡献很少，说明两种微藻细胞内的糖代谢通路完整，其不能利用胞外葡萄糖异养的主要原因是葡萄糖吸收能力太弱。 2.成功实现了 3种外源葡萄糖转运体基因在莱茵衣藻中的表达。 将3个外源葡萄糖转运体基因(Glut1、Hup1、CZGlut1)分别连接到含有壮观霉素抗性和博来霉素抗性的表达载体中，通过基因枪转化法转入莱茵衣藻中，并分别通过壮观霉素和博来霉素筛选获得了阳性转化株，经过目的基因和转录水平检测证明葡萄糖转运体基因Glut1、Hup1和CZGlut1成功转入到莱茵衣藻中并实现了表达。 3.成功实现了 3种外源葡萄糖转运体基因在雨生红球藻中的表达。 将3个外源葡萄糖转运体基因通过基因枪转化法转入雨生红球藻中，利用壮观霉素筛选获得了转化株，通过目的基因和转录水平检测证明葡萄糖转运体基因Glut1、Hup1和CZGlut1成功转入到雨生红球藻中并实现了表达。 4.初步进行了转化株的兼养和异养培养性能评价，获得了多株可利用葡萄糖的兼养转化株。 将获得的各葡萄糖转运体基因的转化株于不同营养条件下进行培养。其中壮观霉素抗性的莱茵衣藻NIT1-aadA-Glut1和35S-aadA-Hup1转化株在兼养条件下达到稳定时的生物量与自养相比分别提高了 50％和45％,博来霉素抗性的莱茵衣藻NIT1-ble-Hup1和Psad-ble-Hup1转化株在兼养条件下达到稳定时的生物量与自养相比分别提高了 45％和39％,雨生红球藻的tub-aadA-CZGlut1转化株在兼养条件下达到稳定时的生物量与自养相比提高了 33％。 5.单细胞拉曼技术检测确证了各转化株具有明显的葡萄糖吸收能力。 利用单细胞拉曼技术检测各转化株对D-Glucose-U-13C的动态吸收能力。12C和13C的拉曼峰值检测分析发现所有莱茵衣藻转化株的D-Glucose-U-13C吸收量都高于野生型，其中NIT1-aadA-Glut1转化株中13C拉曼峰值最高，且在第72 h时葡萄糖吸收达到稳定。色素的13C拉曼峰值检测发现所有雨生红球藻转化株的D-Glucose-U-13C吸收量同样高于野生型，其中tub-aadA-CZGlut1转化株中13C拉曼峰值最高且在第72 h时葡萄糖吸收含量达到稳定。
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