摘要
增强子和启动子是决定基因精准表达的两类关键DNA调控元件。启动子决定了转录起始位置并结合转录机器起始转录，增强子作为转录因子和辅助因子的结合位点，起到激活转录的作用。由于增强子与靶标基因启动子之间线性距离较远，二者需要在空间上形成长距离染色质三维相互作用，称为染色质环。而在增强子-启动子相互作用过程中，目前已发现了一些发挥广泛调控功能的蛋白因子，例如CTCF和YY1蛋白等，还有特异性位点调控因子hnRNPK。其中，hnRNPK能够通过结合特定超级增强子及其靶基因启动子转录产生的RNA来介导长距离染色质成环以实现RNA聚合酶Pol Ⅱ在基因启动子区域的转运和分布，从而调节靶基因转录。但是，hnRNPK的这一调控模型是否可作为普遍机制推广至全基因组水平仍是未知。 为了在全基因组范围内探究hnRNPK激活基因转录的调控机制，我们首先通过ChIP-seq方法鉴定hnRNPK在基因组的结合靶标，据此发现了 hnRNPK在基因转录起始位点的结合偏好性和与Pol Ⅱ定位的正相关关系。并且，利用siRNA敲低hnRNPK蛋白水平之后，PolⅡ在基因启动子区域的结合明显降低。进一步，我们利用HiChIP方法捕获由hnRNPK蛋白介导的增强子-启动子相互作用，并发现这些相互作用的强度与对应位点上Pol Ⅱ的结合也呈现出明显的正相关关系。 同时，我们还发现hnRNPK作为RNA结合蛋白，其在RNA水平上的结合也具有启动子和增强子RNA的偏好性，并且与特定RNA的结合越强，hnRNPK在相应基因位点上的结合能力越强，并且介导的增强子-启动子相互作用强度也越强。这一发现揭示了 hnRNPK与增强子或者启动子RNA的结合能够增强DNA水平上增强子-启动子之间的相互作用。 前期研究显示hnRNPK的转录调控还依赖其与PolⅡ的直接相互作用。由此我们首先确认了hnRNPK与Pol Ⅱ复合体中的RPB3亚基存在直接相互作用，进一步的交联质谱实验鉴定出了两者之间具体的相互作用肽段。另外，作为具有RNA结合能力的转录调控因子，我们通过纯化GFP标记的hnRNPK蛋白和一系列体外实验发现了hnRNPK蛋白具有相分离的能力，并且通过构建内源GFP标记hnRNPK蛋白的稳定细胞系进一步在体内验证了hnRNPK的相分离特性。意外的是，我们还发现虽然RPB3蛋白自身不能发生相分离，但hnRNPK蛋白可以将RPB3蛋白完全包裹从而形成不相融的相互作用液滴状态，这也进一步验证了二者的直接相互作用关系。 金氏综合症与hnRNPK的功能丧失突变有关，但其致病机制尚不清楚。在研究过程中，我们通过体外纯化突变蛋白观察到hnRNPK蛋白发生疾病相关突变之后其相变能力受到明显影响。并且通过体内实验证明了 hnRNPK突变后与Pol Ⅱ的相互作用也受到了影响。通过分析PolⅡChIP-seq数据分析进一步发现，hnRNPK突变之后，Pol Ⅱ在部分发育相关基因如HSPA5和JUNB的启动子区域的结合明显降低。上述实验数据表明疾病相关突变能够改变hnRNPK的相分离能力及其与PolⅡ的相互作用关系，进而影响重要发育相关基因的转录调控，最终导致疾病的发生发展。 综上，我们发现并证明了hnRNPK蛋白是一种新的具有广泛调控作用的染色质结构调控因子，通过介导增强子-启动子相互作用促进PolⅡ传递，并且RNA参与了调控此过程。同时我们还发现hnRNPK具有相分离的能力，并可与PolⅡ亚基RPB3蛋白形成完全包裹但不相融的相互作用状态。此外，金氏综合症相关的hnRNPK突变使其相分离能力明显减弱并影响上述调控机制。这些发现为染色质环调控机制和疾病发生发展研究提供了新的视点和见解。
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