摘要
哺乳动物的中心体是主要的微管组织中心(MTOC),由两个中心粒和周围的中心粒周围物质(PCM)组成。在细胞周期静止期(G0)，含有远端附属物和次远端附属物的母中心粒迁移到细胞表面，成为纤毛形成的基体。原生纤毛存在于几乎所有生长停滞的细胞表面，它对于哺乳动物的发育和组织的形态建成极为重要。纤毛能感知细胞外的化学信号和机械刺激，多种信号通路的胞外信号通过纤毛的信号传导途径传递至细胞内并引起细胞应答，比如:Hedgehog和Wingless信号途径。原生纤毛的缺失或功能紊乱会导致人类一系列的疾病，被称为纤毛病，包括Jeune综合征、Meckel Gruber综合征和Bar det Biedl综合征等。从G1期到G2期，两个中心粒分别复制，中心粒之间由纤维状蛋白结构连接。目前已报导的中心体连接蛋白包括 CEP250、Rootletin、CEP68、LRCC45 和 CENTLEIN 等。最近的研究表明，中心体蛋白对SSC在精子曲细精管极性和精子鞭毛形成中起着重要作用，而中心体蛋白的缺失会导致无头精子或精子尾部缺陷使雄性不育。 本文分成两部分，分别阐述CENTLEIN在纤毛中的作用和CEP250在精子发生中的作用。 1)通过对敲除CENTLEIN的RPE1细胞和小鼠的观察，我们发现CENTLEIN的缺失影响RPE1细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中原生纤毛的形成。通过首轮对13种与纤毛或中心体相关蛋白的筛选，我们发现CENTLEIN与纤毛发生相关蛋白RABIN8相互作用，并结合到它GEF区中的200-230氨基酸片段。RABIN8在中心体周围的聚集的时空定位是纤毛发生早期的事件，CENTLEIN的缺失导致在RPE1细胞中RABIN8积累。激活型RAB8A的表达部分逆转了 CENTLEIN的缺失导致的纤毛缺失，因此确定了 CENTLEIN-RABIN8相互作用在纤毛形成中具有重要作用。另外，在CENTLEIN敲除小鼠中，我们发现CENTLEIN的缺失除了会造成雄性小鼠不育外没有其它明显表型。 2)通过对CEP250敲除小鼠的观察和研究，我们发现CEP250敲除小鼠生殖细胞不能进入减数分裂从而造成雄性不育。通过免疫荧光染色确定了 CEP250在精原细胞中的定位与体细胞相同。通过精子发生过程中典型标志蛋白包括PLZF、DMRT6、c-KIT、STRA8、MEIOSIN 和 SYCP3 的免疫荧光确定了 CEP250缺失的生殖细胞不能进入到减数分裂期，且DMRT6阳性细胞减少。结合不同时间的睾丸切片HE染色以及8天小鼠睾丸细胞流式分选结果，发现CEP250缺失小鼠的生殖细胞增殖和分化会进入到分化型精原时期。分别对Cep250+/+和Cep250-/-8天、9天、10天、11天和12天的睾丸切片进行TUNEL检测，发现Cep250-/-中未能进入减数分裂的细胞在第11天时出现异常的凋亡现象。精原干细胞和分化型精原细胞的中心体免疫荧光的结果表明CEP250缺失后随着细胞增殖分化中心体距离大于2μm的细胞减少。使用q-PCR技术验证了 DMRT6、DMRT1、STRA8和c-KIT在转录水平不受影响。 综上所述，中心体蛋白在纤毛形成和精子发生中均具有重要作用。 1)CENTLEIN通过影响RABIN8的时空定位进而影响了 RAB8的激活从而影响了纤毛的形成。该研究为纤毛形成的细胞内途径增加了新的知识点。 2)与其它大多数中心体蛋白敲除后的不育机制不同，CEP250缺失导致DMRT6的表达下调，生殖细胞发育被阻滞在减数分裂期之前。该研究丰富了中心体蛋白在精子形成中的功能。
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