摘要
药物筛选是新药研发的重要步骤。目前这一步骤主要使用基于自动化移液模块的高通量筛选平台完成，虽然具有高效、快速等优点，但是与其匹配的药效表征通常使用细胞增殖率或形态变化等简单的表型检测方法，难以实现药物对细胞扰动的深入分析。此外，目前的药效表征大多基于细胞群体实现，掩盖了细胞间的异质性，从而忽视了个别细胞对药物的耐药性，导致后期临床试验的失败。新兴的单细胞转录组测序技术可在单细胞层面上表征细胞的状态，有望用于药物效应的深入分析，但是已报道的方法在通量与成本上尚有不足，限制了其广泛应用。 为了高通量地对单细胞药物扰动反应进行深入表征，本论文基于液滴微流控技术，以单细胞测序可寻址的方式对药物条件进行编码，利用微孔阵列装置来完成液滴捕获、随机配对及融合操作，从而实现高通量的给药过程，并结合单细胞转录组测序技术，实现对药物扰动反应的深入表征。 为了实现对药物条件的编码，我们首先利用液滴微流控技术将携带了寡核苷酸序列的刀豆素标记在细胞的表面，其中寡核苷酸序列和药物信息提前绑定，然后通过单细胞转录组测序技术来解码出每个细胞对应的组合药物处理的条件。我们首先优化了液滴操控的实验流程，结果证明液滴直径偏差低于5％,并且在微孔阵列芯片上的液滴操控成功率均高于90％。我们进而使用13种药物对该方法进行了测试，结果表明细胞的基因表达变化与此前的研究报道相一致，从而证实了该方法的可靠性。最后在组合药物处理的验证实验中，我们从78种可能的药物组合中恢复出了 71种药物组合，展示了这个方法在寻找新的有效药物组合方面的巨大应用潜力，证明了该方法有望成为一种用于高通量和深入分析的组合药物扰动筛选技术。 上述方法中的药物信息标记依赖于刀豆素与细胞膜的结合，可能干扰细胞的行为，并且结合亲和度可能随细胞类型改变。为了改进这些局限性，我们提出了基于游离分子标签的液滴标记方法，以实现药物液滴的编码。我们通过将游离的寡核苷酸序列作为药物条形码直接与药物溶液混合并生成液滴的方式来将药物信息与寡核苷酸序列绑定在一起，生成的药物液滴在微孔阵列装置中与单细胞液滴配对并融合。然后我们通过加载测序磁珠液滴并进行第二轮液滴融合来捕获mRNA和药物条形码。我们优化了液滴微流控平台的液滴捕获和二次融合、液滴回收等操作，验证了游离的寡核苷酸序列在液滴内可以被测序磁珠捕获，并且没有交叉污染现象的发生。 综上所述，基于液滴微流控技术，我们提出了两种对药物进行编码的方法，利用微孔阵列装置进行液滴捕获、随机配对及融合的操作来实现高通量的给药过程，并将其与单细胞转录组测序结合，从测序数据中解码出每个细胞对应的药物条件，从而实现单一药物或组合药物对单细胞基因扰动的高通量检测。本课题提出的两种方法都有望发展为两种高通量、低成本、深层次的药物筛选技术，实现对单细胞的高通量分析和对药物扰动反应的深入表征。
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