摘要
背景与目的:肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是肾恶性肿瘤中最常见的亚型，手术是局限性ccRCC的标准治疗方法，但仍有近30％的ccRCC患者出现转移，这成为了目前肾癌治疗领域中的重点与难点。虽然目前免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor,ICI）联合酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKI）靶向治疗的方案在晚期肾癌的治疗中取得了划时代的效果，但仍有部分患者无法从中获益，且目前尚未出现公认的能够预测ICI和TKI治疗反应的生物标志物，因此解决ccRCC患者长期获益问题及找出切实可行的生物标志物迫在眉睫。近日，铜离子介导的一种全新的细胞死亡方式，即“铜死亡（Cuproptosis）"，成为了目前的科研焦点。细胞内过量的铜离子能够通过结合三羧酸（Tricarboxylic acid,TCA）循环中的脂酰化部分，使其异常寡聚，并能够使铁-硫簇蛋白的缺失，从而导致细胞内蛋白毒性累积，最终导致细胞死亡。目前“铜死亡”对ccRCC肿瘤微环境、肿瘤代谢以及生存和药物治疗反应的影响及作用仍未知，其能否为ccRCC预测预后及临床治疗带来新的机遇有待考证。因此，本研究将通过分析转录组学、单细胞测序、代谢组学等多组学数据，并结合复旦大学附属华山医院基因芯片数据和细胞学实验验证的方法，探索“铜死亡”在ccRCC预测预后和药物治疗反应中的潜能，以及挖掘“铜死亡”在ccRCC临床治疗中的潜在应用价值。 材料与方法:数据获取:从公共数据库TCGA（Cancer Genome Atlas）中获取ccRCC患者的转录数据（TCGA-KIRC队列）以及相关的临床信息;从ArrayExpress数据库中获取E-MTAB-1980、E-MTAB-3218和E-MTAB-3267队列的基因芯片数据及相关临床或样本数据;从GEO数据库中获取GSE64052、GSE116442、GSE116446、GSE116448、GSE116450队列的基因芯片数据及样本信息。通过文献检索收集了ccRCC单细胞测序数据及代谢组学数据。另外收集了 2018年11月至2019年2月复旦大学附属华山医院的19例ccRCC患者的肿瘤和正常配对标本，并进行了基因芯片测序。1.在第一部分中，我们首先探究了 10个“铜死亡”基因在ccRCC中的转录组特征以及与临床预后之间的关系。接着利用基因集变异分析（GSVA）的方法计算了“铜死亡”基因集在ccRCC患者中的基因富集评分（Pro-Cup score）,用生存分析探究“铜死亡”富集评分与ccRCC预后的关系。为能更好的预测ccRCC患者预后，我们将Pro-Cup评分与ccRCC临床特征一起进行逐步回归筛选最佳变量，并最终整合构建了线列风险模型。2.在第二部分中，我们对“铜死亡”与ccRCC肿瘤微环境、代谢的关系和对TKI与ICI治疗反应的影响进行了进一步的探索。我们通过ssGSAE和ESTIMATE的算法研究了“铜死亡”与ccRCC肿瘤免疫浸润的关系;通过整合ccRCC代谢组学和转录组学数据，以及利用GSEA的方法研究了“铜死亡”与ccRCC肿瘤代谢的关系。接着利用“pRRopheticPredict”算法预测，并结合真实世界临床数据验证的方法，探究不同Pro-Cup评分水平ccRCC患者之间TKI和ICI治疗反应的异同。3.在第三部分中，我们用不同浓度氯化铜处理786-O人肾癌细胞系及A549人肺癌细胞系，探究不同Pro-Cup评分水平细胞对铜离子毒性的耐受能力。随后用不同浓度的两种铜离子载体处理786-O细胞及A549细胞，观察细胞处理前后生长状态的异同，研究不同Pro-Cup评分水平的细胞对铜离子载体的敏感性，进而验证Pro-Cup评分的合理性。用CCK-8、细胞划痕以及Transwell等实验探究单用铜离子、铜离子载体伊利司莫、以及二者1:1联用对肾癌786-O增殖与迁移能力的影响，进而探究“铜死亡”在ccRCC患者治疗领域的价值。 结果:第一部分:1.我们首先通过分析表明10个“铜死亡”基因均与ccRCC总体生存时间显著相关。FDX1等8个基因表达和Pro-Cup评分在肿瘤与正常组织中差异显著，并在单细胞水平以及复旦大学附属华山医院19例配对样本中得到相同的结果。2.在预后方面，Pro-Cup评分为ccRCC独立的预后指标。高Pro-Cup评分ccRCC患者具有更长的总体生存时间和无进展生存时间。3.高Pro-Cup评分ccRCC患者在更高分期、分级肿瘤中所占比例更低。4.为了突出“铜死亡”对ccRCC预测预后的作用，我们利用逐步回归的方法，最终筛选出Pro-Cup评分、ccRCC的分期、分级、转移、年龄5个变量特征，并一起构建了预测预后的Nomogram模型，该模型预测5年生存率AUC值为0.84,优于ccRCC的分期分级、年龄、性别等临床特征。第二部分:1.通过通路富集分析发现，在高水平Pro-Cup评分的ccRCC患者中，线粒体有氧呼吸相关通路显著富集;并且在更高分级的ccRCC患者中，TCA循环代谢程度显著降低。2.Pro-Cup评分与肿瘤免疫细胞浸润、缺氧和血管生成相关通路的富集呈显著负相关。3.在单细胞水平上，肿瘤细胞的Pro-Cup评分与PD-L1的表达显著负相关。4.与对舒尼替尼和索拉非尼耐药的肾癌细胞相比，对两种TKI敏感的细胞Pro-Cup评分更高。5.临床治疗方面，在真实世界临床数据中，高Pro-Cup评分ccRCC患者对舒尼替尼治疗反应更佳。但对PD-1抑制剂（Nivolumab）治疗反应较差。6.通过“pRRopheticPredict”算法预测发现，高Pro-Cup评分ccRCC患者对舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼和培唑帕尼更敏感。低Pro-Cup评分ccRCC患者替西罗莫司（Temsirolimus,mTOR抑制剂）和替沃扎尼更敏感。第三部分:1.ccRCC细胞系的Pro-Cup评分与双硫仑、伊利司莫、NSC319726敏感性呈负相关。2.与肺癌A549细胞相比，肾癌786-O细胞Pro-Cup评分更低，且对铜离子毒性更耐受。3.与肺癌A549细胞相比，肾癌786-O细胞对伊利司莫和双硫仑诱导诱导的铜离子诱导细胞死亡更耐受。4.伊利司莫与铜离子联用可抑制肾癌786-O细胞的增殖、迁移能力。 结论:在本研究中，我们通过构建“铜死亡”相关Pro-Cup评分，整体探究了“铜死亡”与ccRCC肿瘤微环境、代谢、预后及治疗反应的关系。突出了“铜死亡”对ccRCC预后及临床治疗指导意义。高Pro-Cup评分ccRCC患者具有更好的预后，并且可能对TKI治疗有更好的药物反应，但也可能与ICI治疗更差的治疗反应有关。另外，“铜死亡”相关的Nomogram模型能够较好的预测ccRCC患者预后。最后，铜离子载体诱导的细胞死亡可一定程度上抑制ccRCC细胞的增殖与迁移能力。因此，我们的研究为预测ccRCC患者预后和药物治疗反应提供了新的切入点，同时也为利用“铜死亡”治疗ccRCC提供了一定的理论支持。
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