摘要
硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）作为继一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）后的第三种气体信号分子。在代谢、炎症、信号转导和细胞凋亡等生物学过程中发挥着重要作用，同时还与多种疾病有所关联。因此检测生物体内H2S的含量具有重要意义。与H2S的传统检测方法（如亚甲基蓝法、比色法、色谱分析法等）相比，荧光探针法因具有成本低、灵敏度高、实时检测等优点而得到广泛应用。但现当前已报道的H2S荧光探针多为单荧光检测模式，容易受环境干扰的影响，只能提供活细胞中H2S的定性或半定量信息;另一方面，H2S在活细胞中会实时挥发，为了实现对细胞内H2S含量的精准检测，增强探针的细胞膜通透性至关重要。面对以上问题，本研究基于叠氮基H2S单荧光探针NT-N3（P0）开发了两种新型的H2S荧光探针，Eu-NT-N3和PDS-NT-N3（P1）。其中比率型H2S荧光探针Eu-NT-N3能利用两个波长的荧光强度比值来实现比率测量，对H2S的检测更为精确;探针P1基于细胞膜上的硫醇-二硫键交换机制提高跨膜性，可快速进入细胞实现H2S检测。具体工作内容如下: （1）构建了比率型H2S荧光探针Eu-NT-N3并应用于活细胞内H2S精准检测。以4-溴-1，8-萘二甲酸酐为原料合成H2S荧光探针P0，该探针的叠氮基（-N3）能被H2S还原为氨基（-NH2），继而发出绿色荧光;在确认探针P0对H2S的荧光响应后，使用4-氨基丁酸进一步修饰得到中间产物COOH-NT-N3。利用COOH-NT-N3与表面带氨基的稀土铕复合荧光纳米颗粒Eu在1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺诱导下的缩合反应构建比率型H2S荧光纳米探针Eu-NT-N3。我们对探针P0、COOH-NT-N3和纳米探针Eu-NT-N3进行了光谱性质、绝对量子产率、粒径表征、H2S检测能力、生物相容性、细胞H2S检测等研究。结果表明我们成功制备了探针P0、COOH-NT-N3以及荧光纳米探针Eu-NT-N3。探针Eu-NT-N3具有良好的H2S灵敏度和特异性、对活细胞无明显毒性;荧光强度比（I540/I616）在0.5～30μM H2S浓度范围内有良好的线性响应（R2=0.99136）;可对实现细胞内H2S进行精准检测。 （2）构建了摄取增强型H2S荧光探针P1并应用于活细胞内/外源性H2S检测。以硫辛酸为原料与乙二胺反应制备中间产物PDS,将其与荧光探针P0混合加热制备探针P1。为了验证探针P1是否具有摄取增强的能力，通过Chemdraw软件计算得出P1的辛醇-水分配系数(The calculated octanol-water partition coefficient,CLogP)并合成了与P1的CLogP值相似的H2S探针P2、P3,均完成了核磁、质谱表征。通过高效液相色谱法对比了P0、P1、P2、P3四种探针在活细胞中的摄取情况，确认了探针P1能基于细胞膜上的硫醇-二硫键交换机制增强其细胞摄取能力。随后我们对荧光探针P1的光谱性质、绝对量子产率、响应效率、选择性、pH稳定性、细胞活性检测和在活细胞中对内/外源性H2S的检测进行研究。结果发现探针P1能对H2S产生明显的荧光响应，吸收峰(435nm)和发射峰(545nm)显示较大的Stokes位移(110nm)，这有利于在活细胞中进行荧光显微镜观察。此外该探针绝对量子产率较高为17.8％,能对H2S快速响应，具有较好的特异性、pH稳定性和生物相容性。在细胞实验中，成功实现了内/外源性的H2S检测并确认了其检测亚微摩尔级别H2S的能力。 综上所述，我们成功设计与合成了两种可用于H2S检测的荧光探针Eu-NT-N3和P1，分别能实现细胞内H2S的精准检测和快速进入细胞进行内源性H2S检测。本研究为活细胞内H2S荧光探针的设计与制备提供了新的思路和技术参考，对于细胞局部微环境和精细生命活动的研究具有重要的学术价值。
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