摘要
目的： 骨髓是存在于长骨、扁平骨和不规则骨的松质骨间网眼中的一种海绵状组织，具有造血、免疫和防御等机能，对电离辐射极其敏感[1]。机体在受到急性辐射后会出现造血异常或功能障碍等问题，且极易引发出血、感染等症状，严重者会导致死亡[2]。本课题通过研究中药鸦胆子的苦木内酯类化合物—鸦胆子苦醇(Brusatol，Bru)对60Co γ射线引起的骨髓型急性放射病(Bone Marrow form of Acute Radiation Sickness,BM-ARS)小鼠的防护作用，并对其相关机制进行探究，为辐射所致造血损伤提供新的防治手段及实验依据。 方法： 1、观察致死量照射小鼠不同给药浓度下的存活率:将40只C57B6/J雄性小鼠随机分为IR组、Bru低、中、高浓度(0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5 mg/kg)组共4组，同时接受8.5 Gy 60Co Y射线致死剂量照射，分别于照射前24 h、照射前3 h两个时间点给与Bru组小鼠腹腔注射不同浓度的Bru,IR组给予与Bru1.0mg/kg相同体积的赋型剂。观察小鼠在照射后30天的存活情况。 2、检测6.5 Gy 60CO γ射线照射小鼠在Bru不同给药浓度下的外周血细胞变化:将24只C57雄性小鼠分为IR组、Bru低、中、高浓度(0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、1.5 mg/kg)组共4组，同时接受6.5 Gy 60Co γ射线照射。分别于照射前24h、照射前3h两个时间点给予Bru组小鼠腹腔注射不同浓度的Bru,IR组给予与Bru1.0mg/kg相同体积的赋型剂。观察小鼠照后30天的外周血细胞变化，以确定最佳给药浓度。 3、检测6.5 Gy 60Co γ射线照射小鼠不同给药时间点的外周血细胞变化:将小鼠分为IR组、双时间点给药组(照前24h+照前3h给药)、单时间点给药组(照前3h给药。Bru组小鼠腹腔注射1.0 mg/kg Bru,IR组给予与Bru1.0mg/kg相同体积的赋型剂。同时接受6.5 Gy 60Co γ射线照射，观察30天内的外周血细胞变化，以此确定最佳给药时间。 结果： 1、存活实验观察:Bru提高了致死量照射下小鼠的存活率:与IR组相比较，照前24 h及照前3 h给予Bru腹腔注射显著提高了照后小鼠的存活率，与IR组相比，当Bru浓度为1.0mg/kg时效果最明显(10％vs 50％,P＜0.01)。 2、最佳给药浓度:Bru可明显改善6.5 Gy 60Co γ射线照射后小鼠外周血中主要血细胞的急速减少情况，并加速造血恢复进程，且给药浓度为1.0mg/kg时效果最为明显，与存活实验一致。因此，在本课题中Bru最适浓度为1.0mg/kg。 3、最佳给药时间:小鼠在接受6.5 Gy 60Co γ射线照射后，监测30天内的动态外周血细胞变化，实验结果表明双时间点给药(照前24h+照前3h)的方案对于红细胞(red blood cell，RBC)、白细胞(white blood cell，WBC)、血小板(platelet,PLT)、中性粒细胞(Neutrophils,NE)的保护更为显著。综合前期结果，确定最佳给药方案为Bru浓度为1.0mg/kg，给药时间点为照前24 h和照前3 h。 4.最佳给药方案(Bru 1.0mg/kg,照前24 h+照前3 h给药)下Bru的骨髓辐射防护效果: (1)接受6.5Gy 60Co γ射线照后第14天，HE结果观察到Bru组小鼠股骨骨髓腔内的空泡化少，骨髓细胞密集程度较IR组高。 (2)照后14天骨髓有核细胞计数结果表明，Bru组小鼠骨髓有核细胞数优于 IR 组(3.0±0.51 ×107个 vs 1.9±0.57×107个，P＜0.01);Bru 给药组小鼠的 LK(0.38±0.07％vs 0.19±0.068％,P＜0.01)、LSK(0.04±0.0129％vs 0.018±0.009％,P＜0.05)、LT-HSC(0.014±0.0049％vs 0.005±0.0028％,P＜0.05)、ST-HSC(0.024±0.008％vs 0.006±0.001％，P＜0.05)在 BMNCs中所占比例均不同程度高于IR组小鼠。流式细胞仪检测6.5 Gy 60Co γ射线照后射第14天的HSPCs的凋亡情况，结果显示，与IR组相较，Bru组LK的凋亡比例(14.83％±1.9％vs 22.57％±3.26％，P＜0.01)、LSK 的凋亡比例(9.71％±2.01％vs 16.69％±2.58％,P＜0.01)均低于IR组。这些结果说明Bru明显降低了照射引起的HSPCs的凋亡以及辐射后极期骨髓细胞急速减少的程度。 (3)集落形成实验结果显示:与IR组相比较，Bru组巨核细胞集落形成单位(MK-CFU)(41.3±11.9个vs16±1.7个，P＜0.001)、爆式红系集落生形成单位(BFU-E)(33.6±1.2 个 vs17±6.9 个，P＜0.05)、红系集落形成单位(CFU-E)(54.7±11.8个vs 34.3±5.1个，P＜0.01)、粒细胞巨核细胞集落形成单位(GM-CFU)(86±3 个 vs 50.3±2.5 个，P＜0.0001)、混合集落形成单位(Mix-CFU)(81±6.6个vs 20.7±5.9个，P＜0.0001)集落数均显著高于IR组，说明Bru改善了照后骨髓细胞的增殖能力。 (4)竞争移植实验结果显示，在移植后第4周到第16周，IR组小鼠外周血嵌合率变化趋势呈现下降趋势:即30.25±2.98％、27.78±8.08％、26.74±13.36％和20.73±7.13％;IR+Bru组嵌合率变化趋势为逐步上升趋势:即52.15±2.82％、57.49±12.04％、58.95±11.89％和 60.95±13.15％。在移植后的 4-16 周，对照组小鼠外周血CD45.2的比例出现逐渐下降的趋势，Bru组的小鼠外周血CD45.2的比例稳步上升，呈现平稳趋势。在移植后第12周，与IR组相较，Bru组供体来源的T淋巴细胞比例(43.78±1.58％vs 22.35±4.42％，P＜0.01),B淋巴细胞比例(55.36±20.61％vs 25.67±20.90％，P＜0.01)均显著高于 IR 组。在移植后第16周检测小鼠骨髓细胞中供体来源的LK、LSK比例，与IR组相较，Bru组供体来源的 LK 比例(81.57±5.39％vs31.28±15.28％,P＜0.0001)、LSK比例(84.79±6.31％vs 35.31±15.00％,P＜0.0001)均明显高于 IR 组。基于竞争移植实验的结果，这揭示了 Bru可加速照后小鼠造血多谱系的重建，改善照后造血功能。 5、Nrf2基因缺失后Bru对造血组织的辐射防护作用:当Nrf2基因缺失时，照后14天Bru对于外周血重要血细胞数量的保护作用依然存在。 6、体内及体外实验探索Bru对造血组织的辐射防护机制:ELISA结果显示单独给予Bru 6 h后小鼠外周血G-CSF的含量为1050.4±315.4 pg/ml,与正常对照组相比，给药后6hG-CSF升高50倍。辐射本身也会引起G-CSF升高，单纯照射组G-CSF达到478.9±139.2 pg/ml;照前给药组照后6 h G-CSF的水平为4169.3±1590.905 pg/ml,与IR组相比，可达辐射效应的9倍之多，P＜0.01。Bru作用于RAW264.7细胞后G-CSF、IL-6水平伴随时间和Bru浓度显著升高，且能快速激活NF-κB通路，使得IκBα迅速磷酸化并降解，p50/p65脱离IκB的束缚后从胞质转入胞核进行下游基因的转录。 结论： Bru能够明显降低照后小鼠BMNCs的减少程度，降低HSPCs的凋亡率，提高照后小鼠HSPCs的增殖能力和重建造血的能力，对急性骨髓型放射病小鼠具有良好的防护作用，其作用机制可能与Bru激活了 NF-κB通路及NF-κB通路激活后下游产生了对造血有正向作用的细胞因子(G-CSF、IL-6、TNF-α)有关。
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