摘要
免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade，ICB)疗法在多种癌症治疗中取得突破性进展，但囿于当前ICB疗法的低响应率使得多数患者无法受益，基于对靶点的生物功能和调控机制的深入研究来优化当前的ICB疗法策略是打破低响应率桎梏的基本途径。其中，程序性死亡受体-配体1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)的调控网络得到广泛研究。趋化素样因子超家族成员6(CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing protein 6，CMTM6)可和 PD-L1形成膜复合物，阻遏PD-L1的内体-溶酶体和泛素-蛋白酶体降解，是PD-L1的新型翻译后修饰调控分子。目前，CMTM6的肿瘤生物学研究尚属起步，CMTM6和PD-L1的功能联系研究缺乏深入，且未见CMTM6与肿瘤免疫的系统研究。因此，本课题旨在研究肿瘤及宿主CMTM6在肿瘤进展和肿瘤免疫中的作用及对PD-L1的依赖程度，挖掘其独立于PD-L1的作用和潜在机制，并初步探索靶向CMTM6治疗的应用前景。本课题的主要研究内容和结果如下: 肿瘤细胞CMTM6是肿瘤免疫调控分子。本研究从临床数据出发，发现CMTM6在泛癌种中高表达并和肿瘤进展及患者不良预后相关。我们构建了 6种小鼠肿瘤细胞CMTM6敲除稳转株，发现CMTM6的敲除并不影响肿瘤细胞的体外生长及迁移，但可显著抑制肿瘤体内生长和转移。在临床上，肿瘤CMTM6的表达与多种免疫检查点表达正相关，且与CD8+T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的瘤内浸润负相关。我们也在重度免疫缺陷小鼠NSG和T细胞免疫缺陷小鼠Balb/cnu/nu中均发现肿瘤细胞CMTM6敲除不影响肿瘤的体内生长和转移，类似的免疫系统依赖作用也在人结直肠癌RKO模型中得到验证。进一步，CMTM6敲除的肿瘤内的淋巴细胞可特异性地识别并杀伤肿瘤细胞，且免疫分型及转录组测序显示，肿瘤细胞CMTM6敲除显著提高了免疫细胞的瘤内浸润和功能，尤其是CD8+T细胞和NK细胞。免疫细胞删除实验也直接验证了CD8+T细胞和NK细胞在其中发挥主要作用。此外，我们发现肿瘤CMTM6敲除可使得ICB疗法耐药的4T1肿瘤和LLC肿瘤提高对ICB的响应。 肿瘤细胞CMTM6独立于PD-L1参与肿瘤免疫。基于PD-L1缺陷的肿瘤细胞或PD-1敲除小鼠，实验数据显示此时肿瘤细胞CMTM6的敲除仍可显著阻遏肿瘤。尤其是在MC38肿瘤中，PD-L1敲除不抑制肿瘤生长而CMTM6敲除则可抑制肿瘤生长，凸显了肿瘤CMTM6可独立于PD-L1影响肿瘤生长。在免疫细胞机制上，肿瘤CMTM6独立于PD-L1的作用仍依赖于CD8+T细胞和NK细胞介导的宿主免疫。分子机制上，肿瘤CMTM6敲除抑制了 Akt活化对GSK3β的抑制，从而抑制了 β-catenin的活化，进而提高了趋化因子配体4(chemokine C-C motifligand 4,CCL4)的表达，可提高CD8+T细胞的浸润，发挥抗肿瘤活性。 宿主细胞CMTM6是肿瘤免疫的调控分子。通过单细胞测序数据分析和流式检测发现，CMTM6在免疫细胞中表达广泛，且与PD-L1的表达模式迥异。在CMTM6敲除小鼠中，T细胞活性增强，因此我们主要关注了 CMTM6在宿主T细胞中的作用。在Jurkat-T细胞和人外周血T细胞长期激活时，CMTM6和耗竭指标PD-1/PD-L1的共表达持续增加。在体内，通过单细胞测序数据分析和流式免疫分型发现，CMTM6在耗竭的CD4+T细胞和CD8+T细胞中高表达，且CMTM6缺陷的CD8+T细胞功能更强。进一步，宿主免疫细胞CMTM6的缺失可显著抑制肿瘤的体内进展，并主要依赖于CD8+T细胞。而宿主PD-L1缺失时，进一步敲除宿主CMTM6仍可有效抑制肿瘤生长，说明宿主CMTM6也存在区别于PD-1/PD-L1轴的肿瘤免疫独立调控作用。 靶向CMTM6的基因治疗及联合用药研究。基于以上结果，我们开发了靶向CMTM6 降解的自互补腺相关病毒(self-complementary adeno-associated virus，scAAV)基因治疗候选药物shCMTM6 scAAV9,并发现其可在泛肿瘤水平抑制肿瘤体内进展，并改善了肿瘤免疫微环境。此外，shCMTM6 scAAV9分别联合阿特珠单抗、咪喹莫特、阿霉素、二甲双胍或氟伐他汀，均发挥了强力的抗肿瘤活性，提示了靶向CMTM6的药物的临床开发潜力。 综上，本研究基于CMTM6的临床癌症相关性，鉴定了 CMTM6的表达谱及与免疫耗竭之间的关联，系统研究了肿瘤和宿主CMTM6在泛癌种中调控肿瘤进展和肿瘤免疫的作用。宿主和肿瘤CMTM6的缺陷均可不依赖于PD-L1来重塑肿瘤免疫微环境，并依赖于细胞毒细胞遏制肿瘤进展。本研究开发了 CMTM6靶向的AAV药物，并证明了基于此的肿瘤免疫基因治疗及多种联合用药方案的泛癌种治疗疗效。CMTM6是一种具有极大潜力的肿瘤免疫治疗新靶点。
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