摘要
循环肿瘤细胞（CTCs）已经成为癌症病人诊断、监测和愈后的液体活检标志物，其高效率、高纯度、高活性筛选是推动CTCs实验室检测和临床应用的关键。相比于基于生物特性的微流控分离方法，基于物理特性的分离方法无需生物标记、成本低、操作简单、分离后细胞活性高，因此具有更大的应用潜力。由于数量极少的CTCs隐匿于大量血细胞背景下，并且其物理特性（密度、尺寸、刚度、电磁特性等）和血细胞存在较大差异但又部分相同，因此依靠CTCs与血细胞单一的物理特性差异难以实现CTCs的完整性无标记分离。 本文在综述基于物理特性的微流控无标记CTCs分选技术进展的基础上，以高效率、高纯度、高通量、无标记分选CTCs为目标开展工作，基于CTCs和血细胞的尺寸差异和刚度差异，针对芯片结构优化、精确筛选理论、芯片设计方法、芯片制备工艺、细胞培养方法、细胞溶液制备、芯片性能表征、分选分析系统搭建进行了理论探索与实验研究，并初步探索了单细胞封装技术。本文开发了确定性侧向位移技术（DLD）的液滴形微柱提高了 DLD技术的分选性能;开发了新型的两级阵列DLD芯片实现了 CTCs的高性能分选;提出了控制流体流速的无标记CTCs精确分选理论;基于该理论开发了锥形通道芯片实现了 CTCs的精确筛选;基于开发的微流控器件，结合实验室已有的拉曼显微光谱仪系统，搭建了 CTCs分选分析系统;开发了单细胞封装芯片初步实现了微液滴融合。本文的研究工作如下: 1.本文优化了 DLD技术的微柱形貌获得了液滴形微柱，极大的提高了分选性能。采用贝塞尔曲线拟合了传统圆形，构建参数优化模型并推导了第一流束宽度的计算方程。分析结果表明液滴形微柱的临界尺寸比圆形微柱降低了 21.25±1.91％,吞吐量增加了 28％，比三角形微柱引导流体更顺畅，避免了流体回流并且减少了细胞损伤。本文实施了考虑细胞与微流体耦合作用的双向流固耦合仿真，精确模拟了细胞在微柱阵列内的运动轨迹。 2.本文应用液滴形微柱设计了两级阵列DLD芯片，实现了 CTCs的高性能分选。实验表明该芯片对12μm和20μm的聚苯乙烯粒子的分选纯度为98.20±0.22％和 99.74±0.47％,分选效率为 92.02±0.54％和 99.53±0.45％;两级阵列临界尺寸精确性为90％和94.85％;在血细胞背景下，CTCs的分选纯度为98.25±2.48％，回收效率为96.30±2.10％,通量高达2mL/min。该芯片重复性高，结构简单，实现了高效率、高纯度、高通量的无标记分选。 3.本文提出了精确控制微流道内流体流速的无标记CTCs分选方法并构建了基础理论。将细胞刚度纳入分类依据，实施了 3D固体力学接触仿真和流体力学仿真;分析了细胞穿过狭缝和锥形通道的动力学特性;探究了细胞刚度对分离过程的影响，解析了临界入口流率与细胞尺寸、细胞刚度的关系。 4.本文设计了单狭缝芯片验证了该理论的有效性，并设计了锥形通道芯片精确分离了尺寸接近的白细胞和CTCs。实验表明，在35μL/min的通量下，尺寸接近的癌细胞和白细胞经过锥形通道芯片分离后，癌细胞纯度从9.3％提高到16.67％，提高了 1.8倍，回收效率为75％。 5.本文培养了前列腺癌DU145细胞，制备了各类实验溶液;测量并计算了DU145细胞和白细胞的杨氏模量;研究了聚二甲基硅氧烷（PDMS）和玻璃材质的微流控芯片加工工艺，制备了各类微流控芯片。针对拉曼显微光谱仪系统的实际应用场景，制备了玻璃-打孔PDMS-玻璃微流控聚焦芯片，避免了 PDMS对拉曼信号的影响。 6.本文基于开发的微流控器件，结合拉曼显微光谱仪系统，构建了无标记、高通量、高纯度、高效率CTCs分选和高精度、无标记、无损伤CTCs分析系统，实现了全微流控无标记高性能完整的CTCs分选与细胞分析。针对该系统的潜在应用前景，以封装细胞与测序引物为目标，基于液滴微流控技术开发了单细胞封装芯片并初步实现了微液滴融合。
NETL