摘要
由于人为活动、工业废水排放以及湿地独特的物理和化学性质，红树林成为重金属污染物的储存汇，其中镉(Cd)污染具有较高的生态风险。白骨壤(Avicennia marina)作为红树林的先锋植物，对多种重金属具有较高的耐受性，是研究红树植物重金属污染物耐性机制很好的实验材料。红树林湿地含有丰富的有机质和各种营养元素如碳、氮和硫等，为各种微生物生存提供了良好环境，同时周期性的海水浸淹使其具有还原性生境，这也形成了有利于H2S、NO和CH4产生的条件。已有证据表明这些小分子在调节植物应对环境胁迫过程中有一定的作用。然而，它们是否参与了白骨壤Cd耐性还不是很清楚。 本研究以白骨壤作为研究对象，通过形态水平的叶片表型观察，生理水平的光合荧光参数、Cd含量和Cd流速测定以及分子水平的转录组学分析、生物信息学分析和基因功能验证，确定白骨壤根部Cd吸收关键基因。通过对白骨壤幼苗进行Cd、H2S、NO或CH4单独或是复合处理，分析H2S、NO和CH4对白骨壤根系Cd吸收的影响，解析其分子机制，为提高红树植物Cd耐性提供新的思路和有效措施。本研究取得以下主要结果: 1)在小于25mg/L Cd处理30d时，白骨壤叶片没有明显的中毒症状，表明白骨壤具有较高的耐Cd性。叶绿素荧光参数如电子传递速率(ETR)和光化学猝灭系数(qP)可以作为白骨壤受到Cd胁迫敏感的生物指标。根部Cd流速大小与Cd含量有正相关关系，根部是Cd富集的主要组织部位，细根(直径＜1mm)Cd流入速率大于粗根(直径＞1mm),且根尖分生区和伸长区Cd吸收最为活跃。 2)在Cd处理和对照(Cd_vs_Con)比较组中共鉴定到5238个差异表达基因，GO功能富集显示铁离子结合、序列特异性DNA结合、四吡咯结合、氧化还原酶、转录调节、核苷酸-糖代谢、细胞壁生物发生、半纤维素、果胶以及糖代谢参与到白骨壤根部对Cd胁迫的响应。并且挖掘到312的转运体活性差异表达基因，其中具有无机离子转运和代谢功能的基因有54个，包括重金属离子、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、铵、钼酸盐、钾离子、钠离子、钙以及质膜H+转运基因。 3)200μM硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS，H2S供体)、200μM硝普钠(sodium nitroprusside,SNP,NO供体)或1.3mM CH4预处理降低白骨壤根部Cd的吸收。通过分析H2S→Cd_vs_Cd、NO→Cd_vs_Cd和CH4→Cd_vs_Cd这3个比较组中的差异表达基因，发现戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、苯丙烷、类黄酮以及二苯乙烯/二芳基庚烷/姜醇的生物合成和氮代谢在这3个比较组KEGG通路均显著富集。Venn分析显示，受到小分子H2S、NO或CH4预处理共同上调的具有无机离子转运和代谢功能的基因有8个，共同下调的基因有10个，涉及到重金属离子、硝酸盐、硫酸盐、钼酸盐以及钙的转运等。其中，小分子H2S、NO和CH4预处理均降低AmNramp5a的表达。 4）在白骨壤基因组中鉴定到11个HMA基因家族成员、9个Nramp基因家族成员和15个ZIP基因家族成员。酵母和转基因拟南芥异源表达功能验证表明定位于细胞质膜的AmHMA2、AmNramp1、AmNramp5a、AmNramp5b、AmNramp6、AmIRT1和AmPCR2以及定位于细胞胞质与质膜的AmZIP1和AmZIP5在酵母中显示出Cd转运活性。其中，过表达AmNramp1和AmNramp5的转基因拟南芥对Cd胁迫敏感，同时地上部和根部Cd吸收显著高于野生型。 综上所述，AmNramp1和AmNramp5是负责白骨壤根部Cd吸收的主要转运蛋白。小分子H2S、NO或CH4预处理通过降低AmNramp5a的表达减少白骨壤根部Cd吸收。本研究通过转录组学分析和分子功能验证从白骨壤根中挖掘Cd吸收关键基因，为白骨壤Cd耐性机制提供理论依据，同时为转基因工程培育耐Cd红树植株提供重要的基因资源。本研究评价了小分子H2S、NO和CH4对白骨壤根系Cd吸收的影响，为提高红树植物Cd耐性提供新的思路和有效措施。
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