摘要
肠道病毒(Enterovirus)属于单股正链RNA病毒，为无包膜病毒。基因组长度约 7.5 kb,非编码区(Untranslated region，UTR)包括 5''端(5''UTR)和 3''端(3''UTR)，编码区包括结构蛋白P1区以及非结构蛋白P2和P3区。肠道病毒属包含13个种，分别为Enterovirus A-J和Rhinovirus A-C。肠道病毒A种(Enterovirus A,EVA)中的传统型肠道病毒为引起手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原体，例如常见的肠道病毒A71(Enterovirus A71,EVA71)、柯萨奇病毒 A16(Coxsackievirus A16,CVA16)、柯萨奇病毒 A10(CVA10)等。 基于肠道病毒基因组为载体的研究主要分为两类:包括病毒全长的感染性克隆和缺失P1区的复制型载体。一方面由于肠道病毒基因组较小，难以容纳大片段的外源基因，使得肠道病毒感染性克隆不易拯救且具有遗传不稳定性;另一方面由于肠道病毒载体天然地难以表达膜相关蛋白从而严重阻碍了肠道病毒载体的发展。因此，本课题的主要研究内容为基于Enterovirus A中的传统型肠道病毒，优化其感染性克隆和复制型载体的设计方案，为肠道病毒载体的发展和应用提供新的工具和策略。 本研究首先使用新型荧光素酶(Nanoluc luciferase，Nluc)构建了多个EVAs-Nluc感染性克隆，细胞病变、免疫印迹实验(western blot,WB)、噬斑实验、免疫荧光实验以及一步生长曲线实验表明拯救出了重组rCVA16-Nluc，且rCVA16-Nluc在体内外与不带报告基因的CVA16相比均具有类似的复制活性。进一步地，将rCVA16-Nluc在Vero细胞中连续传代至P10后，通过PCR扩增、测序、qPCR以及荧光素酶实验表明rCVA16-Nluc仍稳定携带Nluc基因并稳定表达荧光素酶。接下来，我们测试了 rCVA16-Nluc在抗病毒药物活性测试以及中和抗体滴定中的应用潜力。尽管成功拯救rCVA16-Nluc，遗憾的是无法从EVA71-Nluc、CVA10-Nluc和CVA7-Nluc的感染性克隆拯救出遗传稳定的报告病毒。随后，本课题采用了只有11个氨基酸的HiBiT标签蛋白，顺利构建了 4种EVAs-HiBiT 感染性克隆，包括 EVA71-HiBiT、CVA16-HiBiT、CVA10-HiBiT 和CVA7-HiBiT。进一步地，细胞病变实验及噬斑实验表示成功拯救出了报告病毒EVA71-HiBiT、CVA16-HiBiT、CVA10-HiBiT 和 CVA7-HiBiT,通过流式细胞术及WB验证了 EVAs-HiBiT具有与野生型病毒的复制和翻译水平接近。EVAs-HiBiT在RD、Hela、Vero和HuH-7细胞中传至P10后，仍能稳定表达HiBiT标签蛋白。抗病毒活性实验表明EVA71-HiBiT、CVA16-HiBiT、CVA10-HiBiT和CVA7-HiBiT具有在高通量抗病毒药物筛选中的应用潜力。 缺失P1区的肠道病毒基因组称为复制子（replicon）,肠道病毒复制型载体则是基于复制子的外源基因表达载体。为解决肠道病毒载体无法表达膜相关蛋白的问题，本研究以EVA71 replicon载体为例，以天然的分泌型荧光素酶-高斯荧光素酶（Gaussia luciferase,Gluc）为报告基因优化了 EVA71 replicon载体。本研究以pcDNA载体为对照载体，首先验证了 EVA71 replicon无法表达分泌型secGluc和膜型memGluc;然后使用5种不同的跨膜区设计:PDGFRβ TM、Spike TM,CD28 TM,PDGFRβ+Spike TM 和 Linker+TM+Linker,荧光素酶实验和WB实验表明使用PDGFRβ TM时，EVA71 replicon不能复制;但使用Spike TM,CD28 TM,PDGFRβ+Spike TM 或 Linker+TM+Linker 时，EVA71 replicon能够复制并表达膜相关蛋白。随后通过TM两端的缺失设计验证了 TM两端的linker序列对EVA71 replicon载体的复制具有重要作用。接下来，通过在跨膜区前引入弗林蛋白酶（Furin）识别位点，EVA71 replicon成功表达了分泌型荧光素酶secGluc。随后通过双基因串联表达设计，荧光素酶实验和WB实验均显示EVA71 replicon能够同时表达两个外源蛋白。最后，荧光素酶活性实验表示LNP包装的71 repopti-memGluc mRNA可以在细胞水平表达memGluc,且活体成像实验表明LNP包装的71repopti-memGluc mRNA也能在小鼠体内高效表达外源基因memGluc。 综上所述，本课题首先采用Nluc报告基因，制备了 EVAs-Nluc肠道病毒感染性克隆并拯救出rCVA16-Nluc。随后，采用HiBiT标签基因制备了 EVAs-HiBiT感染性克隆并顺利拯救出遗传稳定的EVA71-HiBiT、CVA16-HiBiT、CVA10-HiBiT和CVA7-HiBiT。接下来验证了带有报告基因的病毒在药物的抗病毒活性测试以及中和抗体滴定中的应用。此外，我们还以EVA71 replicon为例,优化了肠道病毒复制型载体的设计，使其能够表达不同亚细胞定位的蛋白，并通过LNP包装实验验证了优化后的肠道病毒复制子载体可应用于复制型mRNA疫苗领域。以上结论拓宽了肠道病毒载体的应用范围，并为抗病毒药物筛选提供了平台。
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