摘要
胎盘作为母体与胎儿的交互器官，在整个孕期发挥不同的生物学功能，如介导免疫耐受、缺氧与复氧适应、营养物质及代谢废物运输等，对胎儿的正常发育与生长有十分重要的支持作用。胎盘功能异常可导致一系列妊娠相关疾病的发生与进展，如流产、早产、妊娠期高血压疾病、胎儿生长受限等。阐明正常胎盘发育过程中的调控机制，并以此作为切入点探究胎盘病理性疾病的发病机制与潜在治疗方案意义重大。 N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰是表观遗传学的新兴研究热点，已被发现在人类胚胎发育与多种重要器官的形成过程中起调控作用。这是一类在哺乳动物中保守性较高的RNA修饰，由甲基转移酶、去甲基酶动态修饰，后由甲基化识别蛋白特异性识别，参与调控RNA命运，如RNA剪切、出核、稳定性、翻译等过程。甲基修饰酶-关键分子-甲基化识别蛋白构成m6A修饰调控轴，参与多种生物学功能的调控。既往研究报道，胎盘具有组织特异性RNA m6A修饰，相关关键酶的表达异常与胎盘疾病密切相关。然而，RNA m6A调控轴在正常胎盘发育中的时序特征与功能及其在病理性胎盘相关疾病中的作用尚不清晰。 结合目前文献对RNA m6A调控轴的功能探究，我们推测RNA m6A修饰介导胎盘关键分子的表达改变，调控滋养细胞功能进而维持正常胎盘发育，而这一生理调控轴的紊乱可导致胎盘功能异常。因此，本课题综合胎盘组织 MeRIP(Methylated RNA immunoprecipitation sequencing)测序、胎盘条件性基因敲除小鼠、体外细胞与分子机制实验，系统地阐明RNA m6A调控轴在滋养细胞功能与胎盘发育中的作用与分子机制，并建立调控轴紊乱与胎儿生长受限的相关性，从生理角度切入，为胎儿生长受限的分子诊断与潜在治疗提供实验基础。 第一部分 RNA m6A修饰在胎盘发育中动态调节胎盘功能 目的:系统描绘人类正常胎盘发育过程中RNA m6A修饰的动态调节特征，探究RNA m6A修饰与不同阶段胎盘功能的相关性，并分析其调控模式;筛选并聚焦胎盘发育过程中代表性的RNA m6A关键酶以进行后续功能研究。 方法:收集正常人类不同孕期的胎盘组织，早（孕6-8周）、中（孕18-24周）、晚（孕37周）孕期各3例进行MeRIP测序并对测序结果行RNA m6A修饰区域与基序分析描述RNA m6A修饰的基本特征;比较不同孕期m6A丰度与RNA水平，评估RNA m6A修饰与基因表达的相关性;筛选不同孕期胎盘组织中存在动态m6A修饰峰的RNA,行功能富集分析，建立m6A修饰与胎盘功能的相关性。最后，利用RT-qPCR与免疫组化方法，分别检测人类与小鼠胎盘组织中RNAm6A关键酶的表达水平与细胞定位，筛选可能调控胎盘发育的关键酶。 结果:数据质控后分析发现人类胎盘组织RNA m6A修饰主要富集于CDS区与终止密码子附近的3''UTR区，且修饰基序为GGAC，以上区域修饰偏向性和基序保守性与既往人类其他组织的测序结果一致。RNA m6A修饰丰度与胎盘基因表达稳态密切相关，且不同时期胎盘RNA的m6A修饰丰度动态改变，早孕期m6A丰度较高的基因主要富集于细胞增殖、DNA合成等生理过程，中孕期则主要富集于多器官发育，晚孕期主要富集于激素分泌与代谢调节。此外，RT-qPCR与免疫组化结果显示人类胎盘组织RNA m6A修饰关键酶在不同孕期存在差异表达，其中甲基转移酶WTAP在早孕期胎盘组织中高表达，表达水平随孕周下降。此外，该酶在小鼠胎盘迷路层、连接层中均阳性表达，尤其在滋养巨细胞中呈现高表达水平。 结论:正常胎盘发育过程中，RNA m6A动态修饰多种细胞功能的关键分子，在胎盘功能的阶段性转变中发挥调控作用。甲基转移酶WTAP可能参与调控胎盘发育，可作为关键酶进行后续研究。 第二部分 RNA甲基转移酶WTAP参与调控正常胎盘发育 目的:借助胎盘滋养细胞条件性敲除小鼠模型探究甲基转移酶WTAP在小鼠滋养细胞功能与胎盘发育中的关键作用。 方法:构建胎盘滋养巨细胞Wtap条件性敲除小鼠（Wtapflox/flox;Prl3d1-Cre），Wtapflox/flox;Prl3d1-Cre雄鼠与Wtapflox/flox雌鼠交配后即可同期获得基因型为 Wtapflox/flox;Prl3d1-Cre的敲除小鼠与Wtapflox/flox同窝对照小鼠。分别在胚胎期（Embryonic day，E）12.5天与E16.5进行胎盘、胎鼠称重，并在光镜下观察胎盘与胎鼠的发育情况。采用免疫荧光方法验证滋养巨细胞WTAP敲除效率;组织HE染色评估胎盘发育整体水平与局部滋养巨细胞形态、血管迷路层发育情况;免疫组化方法检测细胞增殖标志物Ki67评估滋养巨细胞增殖水平，血管内皮标志物CD31评估血管迷路层发育水平。 结果:在E12.5与16.5天，滋养巨细胞Wtap条件性敲除小鼠(Wtapflox/flox;Prl3d1-Cre)与其同窝对照小鼠相比，胎盘重量与胎鼠体重均明显下降。光镜下可见条敲小鼠整体发育迟缓、胎盘体积减少并且表面苍白，胎盘血管床表面积相对减少。免疫荧光证实条敲小鼠胎盘滋养巨细胞中WTAP敲除完全。组织学观察进一步发现滋养巨细胞数目明显减少，Ki67阳性增殖细胞数量下降;血管迷路层发育缺陷，CD31阳性标记的血管内皮细胞数量显著减少。 结论:甲基转移酶WTAP在正常胎盘发育过程中有重要调控作用，其胎盘滋养巨细胞敲除小鼠表现为滋养巨细胞增殖水平下降、血管迷路层发育异常，胎盘整体发育缺陷，胎鼠发育迟缓。 第三部分 WTAP-m6A轴介导ANLN/VEGFA转录后修饰调控滋养细胞增殖与分泌的分子机制 目的:结合滋养细胞条敲小鼠表型，在细胞与分子水平深入探究WTAP介导的RNA m6A轴调控滋养细胞增殖与血管生成的分子机制。 方法:构建WTAP过表达与敲减的滋养细胞，采用EdU法检测细胞增殖水平，酶联免疫吸附法与血管生成实验检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor-A,VEGFA)的分泌水平。RNA 测序联合功能富集分析，筛选并聚焦细胞周期的关键分子，采用MeRIP-QPCR验证 WTAP对肌动蛋白结合蛋白(Anillin,Actin Binding Protein，ANLN)mRNA m6A水平的调控，RNA稳定性实验检测 WTAP对ANLN mRNA稳定性的影响，蛋白翻译与稳定性实验检测WTAP对ANLN蛋白翻译起始与降解的调控。数据库筛选ANLN可能的甲基化识别蛋白并采用RIP-QPCR验证识别蛋白与ANLN mRNA的结合。双荧光素酶实验筛选并验证受WTAP调控的ANLN m6A修饰位点。以上述方法类似地检测WTAP对VEGFA的m6A调控机制。 结果:滋养细胞过表达WTAP后细胞增殖能力显著增加，而敲减WTAP后增殖水平受到明显抑制。对WTAP敲低的滋养细胞进行RNA测序并将差异基因进行功能富集分析发现其主要富集于细胞周期、DNA复制等关键过程，从中筛选并聚焦细胞周期关键分子ANLN。RT-qPCR与WB实验均证实WTAP敲低后，ANLN表达水平下降，且ANLN过表达可回补WTAP敲低对滋养细胞增殖的抑制作用。RNA与蛋白稳定性实验证实WTAP敲低可明显降低ANLN mRNA的稳定性及翻译效率。MeRIP-QPCR与双荧光素酶报告基因实验验证WTAP介导ANLN CDS区的m6A修饰（AGACT）。该修饰位点受甲基化识别蛋白IGF2BP3的识别，IGF2BP3敲低后ANLN表达水平明显下降，提示IGF2BP3与WTAP共同调控ANLN的转录后代谢过程。类似的，WTAP-m6A-IGF2BP3轴增加VEGFA的表达水平，调控滋养细胞VEGFA的分泌。 结论:WTAP-m6A-IGF2BP3轴调控细胞周期关键分子ANLN与血管内皮生长因子VEGFA的转录后代谢过程，增加RNA稳定性与翻译效率，促进滋养细胞增殖与VEGFA分泌，参与胎盘形成。 第四部分 WTAP-ANLN-IGF2BP3调控轴紊乱与胎儿生长受限的相关性分析 目的:探究WTAP-ANLN-IGF2BP3调控轴紊乱与胎儿生长受限的相关性。 方法:收集胎儿生长受限胎盘组织与同期正常分娩胎盘组织各20例，采用RT-qPCR方法检测两组胎盘组织中WTAP、IGF2BP3与ANLN的mRNA水平差异，采用免疫印迹与免疫组化方法同样验证两组中上述蛋白的表达差异，并用免疫组化检测细胞增殖标志物Ki67评估胎儿生长受限胎盘组织中滋养细胞的增殖水平。 结果:胎儿生长受限胎盘组织中WTAP的mRNA水平较正常分娩组有下降趋势，然而并无明显统计学差异;而IGF2BP3与ANLN的mRNA水平均明显下降。在蛋白表达水平,WTAP、IGF2BP3与ANLN在胎儿生长受限胎盘组织中均明显下降，同时胎儿生长受限胎盘组织滋养细胞的Ki67水平也明显下降。 结论:胎儿生长受限胎盘组织滋养细胞增殖能力下降，与WTAP-ANLN-IGF2BP3调控轴紊乱相关。
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