摘要
本文分为以下几个部分进行探讨： 第一部分 三维心脏器官芯片的构建 目的:本部分的研究目的是为了确定心肌细胞3D培养的合适条件，保证心肌细胞在GelMA中依然能具有较高的生存率和收缩性，同时需要保证GelMA的硬度可以承受后续施加的机械刺激。 方法:通过设置不同浓度、不同取代度的GelMA,观察GelMA光固化后的成型性。选取75％取代度的GelMA，配置浓度为5％和10％的GelMA光固化后在磷酸盐缓冲溶液(Phosphate-buffered saline,PBS)中培养24、48和96小时后测定溶胀率。通过将GelMA固化前加入细胞密度为5×106/ml的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast Cells,3T3)和空白组进行对照，观察固化后 GelMA的溶胀和降解情况，并通过电镜扫描观察GelMA的微孔结构的改变。通过死活染色检测心肌细胞的生存率，同时观察细胞在胶内的伸展排列情况及心肌细胞的收缩活动。为进一步研究3D培养是否有助于心肌细胞成熟，提取2D和3D培养心肌细胞的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),通过实时定量PCR检测(Polymerase Chain,PCR)心肌细胞成熟基因的相对表达。 结果:我们合成了不同取代度的GelMA,再将不同取代度的GelMA配置成不同浓度，进行成型性检测，结果显示取代度为24％的GelMA不易成型，75％取代度的GelMA成型性一般，93％取代度的GelMA的成型性最佳。溶胀率测定的结果表明，对于5％和10％浓度的GelMA,溶胀都主要发生在前24h内，24h后溶胀率几乎恒定。5％GelMA的溶胀率大于10％GelMA的溶胀率。降解率的测定结果显示随着孵育时间的增加，GelMA的降解率也随之增加。5％的GelMA降解速度比10％的GelMA快，相应时间低浓度的GelMA的降解率更高。电镜扫描图显示包封的细胞导致GelMA水凝胶的微孔结构破坏的更明显，通过统计电镜扫描图的微观孔径变化，结果显示GelMA的溶胀和降解主要发生在培养的首个24小时，并且混入细胞后水凝胶的降解会更加明显。我们选取75％和93％取代度的GelMA,都以10％的浓度混入1×107/ml的心肌细胞，以同样的光固化条件使GelMA成型，孵育24h后，93％取代度的GelMA形态稳定，而75％取代度的GelMA几乎完全降解，因此我们最后选取93％取代度的GelMA进行下一步的实验。LIVE/DEAD细胞活性染色结果显示虽然5％浓度的水凝胶细胞生长状态最好，但由于成型性较差，硬度较低，无法承受后续机械拉伸的负荷。10％的GelMA虽然生存率稍低，但水凝胶的硬度能够承受机械拉伸负荷，故而研究最后选择10％浓度的水凝胶。实时定量PCR结果显示3D培养能促进心肌细胞进一步成熟。 结论:GelMA溶胀发生在前24h内，随着细胞的加入会增加GelMA的降解。GelMA水凝胶具有良好的生物相容性和力学稳定性。3D培养能够促进心肌细胞的进一步成熟，心肌细胞在胶内能够良好的伸展和收缩，在培养后期水凝胶块可以整体收缩，可作为令人满意的3D细胞培养的平台。 第二部分 生理仿真三维心脏器官芯片对心肌组织的模拟结果验证 目的:本部分的研究目的是构建生理仿真三维心脏器官芯片的模型，该平台可以更好的模拟心肌细胞体内的病理生理环境，促进心肌细胞进一步发育成熟。 方法:我们使用了 ANSYS软件模拟水凝胶的张力分布，确定合适的芯片模型。选用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)作为芯片骨架的材料，GelMA作为模仿天然基质的3D培养支架。为了模仿心肌细胞的力学环境，我们构建了机械刺激装置，我们通过微型计算控制器设置参数，用气泵带动气动滑轨对心肌细胞实现外部机械刺激。为了模拟心肌细胞的电生理环境，我们通过碳棒和铂丝构成正负电极，通过与外部电刺激器相连接构成芯片内部的刺激电场，调整电压、频率、波形、脉冲时间，以确定适宜的电刺激条件。在给予机械刺激和电刺激后，观察细胞跳动行为，并利用免疫荧光染色和实时定量PCR观察细胞的排列方向和成熟性。 结果:通过利用有限元分析模拟6种芯片模型的力学分布情况，我们选择了圆柱体2×3排列的模型用于实验。我们构建了能精准设置参数，对心肌细胞施加机电刺激的生理仿真三维心脏器官芯片系统，通过设置不同的波形，电压幅度，电刺激频率，脉冲持续时间，确定合适的电刺激条件为双向方波，3.5V的电压、逐渐增强的电刺激频率、2ms的脉冲时间，机械刺激的适宜条件是10％的拉伸幅度,频率为1HZ。免疫荧光染色和实时定量PCR显示单独的电刺激或机械刺激后的心肌细胞都比空白对照的心肌细胞排列方向更为一致，Cx43的表达更高，成熟性相关基因的相对表达量更高，心肌细胞更加成熟。与单一的刺激相比，即施加电刺激又施加机械刺激对促进心肌细胞成熟的作用更加明显。 结论:该生理仿真三维心脏器官芯片装置能够对3D水凝胶组织施加机械刺激和电刺激，较好地模拟体内的生理环境，可以作为培养体外心肌微组织的平台。虽然机械刺激和电刺激均可使得心肌细胞在胶内更好的伸展，细胞排列的方向更加一致，间隙连接蛋白表达升高，心肌细胞更加成熟，但是施加电刺激后的心肌细胞变化更加明显。同时施加机械刺激和电刺激比单一的刺激更能促进心肌细胞的发育成熟。 第三部分 生理仿真肥厚性心肌病特异性类器官模型的构建及应用 目的:人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞(Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)作为研究心脏发育、疾病建模和药物筛选的工具细胞而言具有巨大潜力，然而hiPSC-CMs构成的心肌组织在收缩机制、钙瞬变和转录组谱等心肌功能方面被认为是不成熟的，这阻止了它们在研究心脏发育和心血管疾病的机制等方面的进一步应用。肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy,HCM)的特征是心室壁异常增厚，心律失常、猝死和心力衰竭的风险增加，为了研究HCM的治病机制，已经使用了各种动物模型，包括从啮齿动物到大型动物，然而，显著的种间差异使动物的研究结果难以类推到人类身上,hiPSC-CMs使构建各种心血管疾病的患者特异性疾病建模成为可能，为建立HCM的人类细胞建模平台提供了的机会。本部分的研究目的是构建正常人类体外心肌组织，建立HCM的人类体外疾病模型并进行相关的药物实验，验证模型的可行性。 方法:我们通过将正常人和MYH7突变的HCM病患者的外周血进行重编程后，诱导为诱导性多能干细胞(human Induced pluripotent stem cell,hiPSC),通过免疫荧光染色证明hiPSC的多功能性。将hiPSC在体外扩增后，诱导分化成心肌细胞，通过光镜下观察诱导分化的细胞是否具有心肌细胞特有的收缩活动并利用心肌细胞特异性免疫荧光染色证明所诱导分化的细胞为具有生理功能的心肌细胞。为了得到正常的心肌组织和HCM的疾病模型，我们将心肌细胞种入上文所构建的器官芯片模型中。组织模型建立后进行药物测试，通过钙瞬时变染色反应心肌细胞内部钙离子的变化，观察药物对心肌组织的影响。进一步改进模型，使模型变得更加高通量，减少实验分组的细胞使用量，将hiPSC诱导为心脏类器官，通过观察光镜下心脏类器官的收缩活动，结构分化，以及免疫荧光染色检测诱导分化的结果。 结果:得到了具有多动能性的hiPSC,通过hiPSC诱导的hiPSC-CMs具有收缩活动，免疫荧光染色结果可见明显的心肌肌节，钙瞬时变染色的结果显示HCM组舒张期心肌细胞内的Ca2+的浓度显著高于对照组，通过施加咖啡因诱导钙离子转运，肌质网的Ca2+负荷在HCM组的iPSC-CM中更高，并且HCM组的iPSC-CM对咖啡因的反应时间更长。我们对正常组和HCM的iPSC-CMs给予β受体的激动剂异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO,1μM)进行短期处理，结果显示ISO没有改变对照组舒张期Ca2+的浓度，但是增加了 Ca2+进出细胞的频率。然而，在MYH7突变的iPSC-CM中，ISO显著增加舒张期Ca2+的浓度，说明ISO可能会抑制心肌细胞的舒张功能。通过对HCM组hiPSC-CMs适宜浓度的Ca2+阻滞剂，结果显示施加适宜浓度的Ca2+阻滞剂可以恢复hiPSC-CMs舒张期的Ca2+的浓度。分化诱导的心脏类器官可以在分化第七天看到明显的腔室结构，并表现出良好的收缩活动，免疫荧光染色的结果证明心肌细胞的特异性。 结论:本部分的研究证明构建的生理仿真三维心脏器官芯片有望进行药物筛选，与动物实验结果形成互补。生理仿真三维心脏器官芯片还可以建立遗传性心脏病的体外模型，有利于个性化医疗的发展。
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