摘要
细颗粒物(Particular matter 2.5,PM2.5)是我国大气中的主要污染物，母体PM2.5暴露会导致低出生体重(Low birth weight，LBW)的发生，但其作用机制尚不清楚。烟酰胺和叶酸是胎儿发育过程中所需的重要B族维生素，烟酰胺摄入不足会增加新生儿先天性心脏病的发生风险，而叶酸已经被广泛用于预防胎儿神经管缺陷。然而，尚不清楚烟酰胺和叶酸是否能改善PM2.5诱发的胎儿发育迟缓。因此，本研究拟探讨母体PM2.5暴露对胎鼠发育的影响及其作用机制，并初步评价烟酰胺和叶酸等药物在细胞水平上的干预效果和作用途径。 第一部分研究主要观察母体PM2.5暴露是否会导致胎鼠宫内发育迟缓。将4周龄C57BL/6J雌鼠随机分为两组，每组各30只，在妊娠前3个月至妊娠期(Gestationalday,GD)第16.5天(GD16.5,见栓当日计为GD0.5)分别暴露于过滤空气(Filtered air，FA)(对照组)和浓缩空气 PM2.5(Concentrated ambient PM2.5,CAP)(CAP组)中，于GD17.5检测母鼠主要脏器的重量变化，并分别于GD17.5和自然分娩后检测胎鼠和仔鼠发育情况。结果显示，与对照组相比，CAP组GD17.5胎鼠和新生仔鼠的体重、体长和尾长均显著降低，且与胎鼠或仔鼠的性别无关;此外，两组母鼠GD17.5子宫内胎鼠总数、死胎数、活胎数、吸收胎数和胎鼠性别比，以及分娩时的妊娠时长、窝仔总数、死仔数、活仔数和新生仔鼠性别比均未见显著性差异。与对照组相比，CAP组母鼠的骨骼肌相对质量显著降低，但肾周脂肪重量显著增高，提示PM2.5暴露可能会影响妊娠期母鼠的代谢功能。上述结果提示，母体PM2.5暴露所诱发的仔鼠LBW表型是由胎鼠宫内发育迟缓(Intrauterine growth retardation，IUGR)所致。 第二部分研究主要探讨母体PM2.5暴露所致宫内发育迟缓是否与胎盘功能异常相关。我们利用上一部分研究中建立的CAP母体暴露小鼠模型，通过代谢组学检测，比较对照组和CAP组GD17.5孕鼠血清和胎盘组织中小分子代谢物的含量，并通过生物信息学分析，评估胎盘对营养物质转运能力的变化。结果显示，与对照组相比，CAP组母鼠血清和胎盘组织的代谢谱均存在显著差异，主要涉及维生素消化与吸收、花生四烯酸代谢和cAMP信号通路。CAP组母鼠血清烟酰胺和甘油磷脂含量显著降低，而溶血磷脂类物质含量显著增高;胎盘组织中溶血磷脂酸的水平显著升高，但前列腺素(Prostaglandin,PG)A1、PGE1和PGE2的水平却显著降低，而且蛋氨酸和磷脂酰胆碱转运比例也显著增加。此外，与对照组相比，CAP组胎盘中L型氨基酸转运蛋白1(L-type amino acid transporter，LAT1),以及脂肪酸转运蛋白 1(Fatty acid transport protein 1，FATP1)、CD36、脂滴包被蛋白(Perilipin，PLIN)的表达水平均显著升高，而LAT2的表达水平显著降低。上述结果提示，母体PM2.5暴露所诱发的胎鼠宫内发育迟缓可能是由胎盘代谢功能和/或营养转运功能异常所致。 第三部分研究主要探讨母体PM2.5暴露是否通过影响滋养层细胞分化和螺旋动脉重塑而导致胎盘功能异常。通过胎盘组织形态学观察，以及免疫组化和Western blot检测，观察比较了对照组和CAP组GD17.5胎盘蜕膜区螺旋动脉重塑程度和迷路区血管发育水平，以及各类滋养层细胞谱系基因标志物、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)分子通路和胰岛素样生长因子(Insulin like growth factor，IGF)分子通路的表达水平。结果表明，与对照组相比，CAP组GD17.5胎盘表面积以及胎盘交界区面积显著降低，交界区海绵滋养层细胞和顶叶滋养层巨细胞的标志物水平也显著降低;虽然CAP组胎盘迷路区面积无明显变化，但迷路区合体滋养层细胞标志物表达水平显著升高，而且迷路区母体血窦和胎儿毛细血管平均面积均显著降低;此外，CAP组胎盘螺旋动脉滋养层巨细胞标志物表达量，以及螺旋动脉管腔面积和管腔周长均显著降低，而血管平滑肌细胞增多。与对照组相比，CAP组胎盘中VEGFA和胎盘生长因子(Placental growth factor,PLGF)的表达水平显著降低，而VEGF受体fms相关酪氨酸激酶 1(Fms related tyrosine kinase 1,FLT1)和胎肝激酶-1(Fetal liver kinase-1,FLK1)的表达水平显著增高，但胎盘和胎肝中IGF1、IGF2及其受体IGF1R、IGF2R,以及IGF结合蛋白IGFBP1和IGFBP2的表达水平均无明显变化。上述结果提示，母体PM2.5暴露引起的胎盘功能异常可能是由侵袭性滋养层细胞发育不足和VEGF分子通路活性失衡所造成的螺旋动脉重塑受阻所致。 第四部分研究主要探讨PM2.5暴露所致的肺部炎症是否通过影响胎盘组织局部免疫活性而导致螺旋动脉重塑受阻。通过RT-qPCR和流式CBA法观察小鼠母体肺部、外周血清和胎盘中各类炎症因子的基因表达水平和蛋白含量，并通过转录组测序和生物信息学分析，筛选胎盘中存在差异表达的基因及其相关信号通路。结果显示，与对照组相比，CAP组母鼠肺组织肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNFα)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL6)和干扰素 γ(Interferon γ,IFNγ)的表达水平，以及外周血清TNFα和单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP1)含量均显著增高;胎盘中促炎因子IL6、IL12(p70)和IFNγ，氧化应激水平标志分子硫氧还蛋白1(Thioredoxin，Txn1)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的表达量，以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量均明显增加;胎盘基因表达谱发生显著变化，TNF信号通路和NF-κB信号通路活性显著增强，NF-κB下游信号分子细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM1)和血管细胞粘附因子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM1)的表达水平也显著上调。此外，用PM2.5非水溶性组分处理人肺上皮细胞系BEAS-2B后，细胞中NF-κB和AP-1活性显著增强，而经水溶性组分处理的细胞未见明显改变。上述结果提示，PM2.5暴露所致的母体肺部炎症会导致外周血中TNFα含量增高，进而激活胎盘组织中NF-κB信号通路并诱导炎症反应和氧化应激，从而影响螺旋动脉重塑过程。 第五部分研究主要探讨TNFα损伤人绒毛外滋养层细胞生理功能的分子机制以及烟酰胺和叶酸等药物的干预效应。通过转染PLGF-siRNA或FLT1表达质粒，在早孕期人绒毛外滋养层细胞系HTR8/SVneo中敲降PLGF或过表达FLT1，或直接用TNFα处理HTR8/SVneo细胞，观察细胞生理活性的变化;分别用烟酰胺、叶酸和5-甲基四氢叶酸处理HTR8/SVneo细胞，观察其对TNFα所致细胞表型的干预效应。结果发现，敲降PLGF或过表达FLT1均会导致HTR8/SVneo细胞增殖、迁移和侵袭活性的显著下降;TNFα处理后，细胞的迁移和侵袭活性显著下降，而且细胞中FLT1表达水平显著上调，但PLGF表达水平没有明显变化;用FLT1-siRNA敲降细胞中FLT1的表达，可有效逆转TNFα诱导的滋细胞迁移和侵袭障碍表型。此外，TNFα能促进HTR8/SVneo细胞中p65的核转位和磷酸化水平，以及NF-κB通路下游效应因子ICAM1和VCAM1的表达，并促进细胞中活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)水平的显著增高。烟酰胺能显著抑制TNFα诱导的HTR8/SVneo细胞中NF-κB激活、FLT1表达及ROS水平升高，而且细胞的迁移和侵袭障碍也得以显著改善。叶酸、5-甲基四氢叶酸对TNFα诱导的NF-κB激活和FLT1表达没有明显影响，但能显著降低细胞中ROS含量，并改善细胞的迁移活性。上述结果提示，TNFα可能通过激活NF-κB/FLT1信号轴和刺激ROS产生而抑制绒毛外滋养层细胞的迁移和侵袭，进而导致螺旋动脉重塑异常，而烟酰胺和叶酸可明显改善TNFα诱导的绒毛外滋养层细胞功能障碍。 综上，本研究结果表明，母体PM2.5吸入暴露可能通过诱发母体肺部炎症而促进TNFα的产生，作用于母胎界面后导致绒毛外滋养层细胞中NF-κB/FLT1信号轴激活以及ROS过度产生，抑制滋养层细胞的迁移和侵袭活性，干扰螺旋动脉重塑过程而影响胎盘的正常发育和营养转运功能，进而导致胎儿宫内发育迟缓;烟酰胺能通过抑制NF-κB/FLT1信号轴激活以及ROS过度产生，显著改善TNFα诱导的滋养层细胞功能障碍，而叶酸和5-甲基四氢叶酸可通过减少ROS产生部分缓解滋养层细胞功能障碍，在防治母体PM2.5暴露所致胎儿发育异常方面有潜在的应用前景。
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