摘要
目的： 本研究从辽宁锦州地区分离到1株黑蜂王台病毒(Black Queen Cell Virus,BQCV)的全基因序列，并命名为 BQCV-LN2022(GenBank:OQ799601),进行全基因组克隆及基因序列分析。为BQCV遗传背景研究奠定了基础。在前期研究上，选取BQCV-LN2022结构蛋白基因中的高度保守区段为靶基因，利用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)与侧流层析试纸(Lateral Flow Dipstick，LFD)技术建立快速检测BQCV的RPA-LFD检测方法，为BQCV的防治提供参考与技术储备。 方法： 经过筛选和纯化从采取的病料中提取RNA,并使用RT-PCR技术进行检测，确定结果呈BQCV阳性，将之命名为BQCV-LN2022。参考BQCV-JL2016(MZ821803.1)基因序列利用Primer premier6.0软件设计、合成13对引物对分离到的BQCV进行全基因克隆。分别以非结构蛋白基因与结构蛋白基因为靶基因，与GenBank收录的来自不同地区的26株BQCV分离株序列进行同源性比较，利用MEGA7.0构建BQCV系统进化树，研究分离株的遗传进化关系。以BQCV-LN2022高度保守的结构蛋白区段(7903～8322bp)为基础，设计了RPA特异性引物和探针，进而结合测流层析试纸技术设计了 BQCV的RT-RPA-LFD检测方法，并通过优化引物和探针对组合，评估该方法的特异性、敏感性和重复性。 结果： 本研究分离到的BQCV-LN2022,基因组全长8449bp,包含有两个开放阅读框(ORF)。其中编码非结构蛋白的ORF1位于全基因的642～5528bp处，编码结构蛋白的ORF2位于全基因的5845～8298bp处。同源性分析结果表明:BQCV-LN2022和其余26株BQCV相比，非结构蛋白核苷酸序列同源性为87.4％～97.9％，与 SH2019 株同源性最高，达到 97.9％,与 Australia-Sydeny株同源性最低，为87.4％。BQCV-LN2022的结构蛋白核苷酸序列同源性为89.4％～98.8％,与 JL2016 株同源性最高，达到 98.8％。与 Australia-Sydeny 株同源性最低，为89.4％。箱型图表明BQCV-LN2022结构蛋白的序列同源性值整体分布相较于非结构蛋白的同源性值更加集中。尽管在核苷酸序列上非结构蛋白相较于结构蛋白同源性更低，差异更大，但氨基酸序列上结构蛋白与非结构蛋白同源性值整体分布差别不大。以BQCV非结构蛋白为靶基因构建发育进化树，形成2个分支，FJ2019和SH2019同属一个子簇，BQCV-LN2022与它们共属一个分支。以结构蛋白为靶基因做遗传进化分析，进化树也形成2个分支SD2019和HN2019同属一个子簇中，BQCV-LN2022则与他们共属一个分支。对BQCV-LN2022的N型糖基化位点进行预测，预测到3个可能的糖基化位点，分别位于 112 aa、314 aa、577 aa。 筛选获得最佳RPA引物对和探针组合，其扩增的目的片段为199 bp,最佳反应温度37℃,反应时间为30min;检测下限为1.26×101拷贝/μL;特异性结果显示，只有BQCV出现特异性曲线，与其他常见蜜蜂病毒无交叉反应。显示出良好的特异性和敏感性。之后结合了 RPA技术与LFD(侧流层析试纸)技术，使BQCV病原检测更加易于判别，建立RT-RPA-LFD快速检测方法。其检测温度范围为20℃～50℃,最低检测时间5min,最佳检测时间15min,检测下限为1.26×101拷贝/μL。利用该方法对24份临床样本进行检测，检出阳性样本21份，与RT-qPCR检测结果相同，因此可以作为临床检测的有效工具。 结论： 1、成功获得BQCV-LN2022(GenBank:OQ799601)的全基因序列，其结构蛋白核苷酸序列与JL2016株(MZ821803.1)同源性最高，达到98.8％,与Australia-Sydeny(MW390818.1)同源性最低，为89.4％。非结构蛋白核苷酸序列与SH2019(MZ821815.1)同源性最高，达到97.9％。与Australia-Sydeny(MW390818.1)同源性最低，为 87.4％。且 BQCV-LN2022 与 FJ2019(MZ821801.1)和 SH2019 株(MZ821815.1)同属于一个进化簇。对 BQCV-LN2022的N型糖基化位点进行预测，预测到3个可能的糖基化位点，分别位于112aa、314aa、577aa。 2、成功建立黑蜂王台病毒的RPA-LFD检测方法，该方法检测下限为1.26× 101拷贝/μL，最低检测时间5min,最佳检测时间15min,检测温度范围为20℃～50℃。且与其他常见蜜蜂病毒无交叉反应，具有很好的敏感性和特异性，而且用时更短，操作简便，结果可视化易于直观判断，适合BQCV现场检测与推广应用。
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