摘要
本研究首先通过临床收集高血压致终末心衰心脏移植标本，Western blot检测发现MARCH2蛋白在终末心衰心脏移植标本中表达明显下调，进一步分析发现MARCH2蛋白水平与ANP、BNP基因表达水平呈负相关，提示MARCH2可能参与心力衰竭的发生发展过程。接下来，在动物水平通过主动脉弓缩窄手术(TAC)诱导压力超负荷心衰小鼠模型，Western Blot检测TAC手术后小鼠心肌组织总蛋白，结果显示随着造模时间的延长，MARCH2蛋白水平逐渐下调。接下来，我们体外分离TAC术后成年小鼠心肌细胞和非心肌细胞，Western Blot检测不同细胞亚型中MARCH2蛋白表达情况,结果显示TAC术后MARCH2蛋白主要在心肌细胞中明显下调。对体外培养的HL-1心肌细胞系给予PE(50μM，48h)刺激，发现MARCH2蛋白也明显下调。综上结果提示MARCH2可能在压力超负荷介导的心力衰竭发生发展过程中发挥作用。 第一部分 MARCH2改善压力超负荷诱导心衰小鼠心脏重构 目的:探讨MARCH2在压力超负荷介导的心脏重构发生发展过程中的具体作用。 方法:临床收集由高血压致终末心衰心脏移植标本和正常对照组标本，提取心肌组织总蛋白Western Blot检测MARCH2蛋白表达水平;石蜡固定组织切片免疫组化染色分析MARCH2蛋白变化情况;提取心肌组织总RNA，RT-qPCR检测ANP、BNP基因表达水平，进一步分析MARCH2蛋白水平与ANP、BNP基因表达水平的相关性。在动物水平，选取8-10周龄野生型C57B/L6小鼠行TAC手术构建心力衰竭小鼠模型，分为假手术组、TAC 1周、TAC 2周、TAC 4周以及TAC 8周组，取材后提取心肌组织蛋白检测MARCH2表达情况;同时分离TAC 8周后成年小鼠心肌细胞和非心肌细胞，Western Blot检测心肌细胞和非心肌细胞中MARCH2蛋白表达水平。在细胞水平上，我们使用PE（50 μM，48h）刺激体外培养HL-1心肌细胞系，提取心肌细胞蛋白检测MARCH2表达水平。进一步，我们选取5-6周C57B/L6小鼠尾静脉注射AAV9-cTnT-MARCH2腺相关病毒（2*1011 vg/只），三周后待MARCH2稳定表达行TAC手术。术后8周使用压力导管检测动脉血压;心动图检测小鼠心脏结构和功能变化;H&E染色、Masson染色、WGA染色和Tunel染色明确心肌细胞横截面积大小、纤维化面积和心肌细胞凋亡情况。体外培养HL-1心肌细胞系，使用Adv-MARCH2腺病毒过表达MARCH2后PE刺激HL-1心肌细胞48小时，检测MARCH2、Bax、Bcl2和C-caspase3凋亡相关蛋白水平。同时分离原代小鼠心肌细胞，利用Seahorse检测各组原代小鼠心肌细胞线粒体氧气消耗量(OCR)，并量化分析基础呼吸值(Basel respiration)、ATP产生量(ATP production)、最大耗氧量(Maximal respiration)以及剩余呼吸能力( Spare respiration capacity)。为了进一步研究MARCH2对心衰的影响，我们构建MARCH2全身敲除转基因小鼠，行TAC手术，术后8周超声心动图检测小鼠心脏结构和功能变化;H&E染色、Masson染色、WGA染色和Tunel染色，明确心肌细胞横截面积大小、纤维化面积和心肌细胞凋亡情况。细胞水平上，体外培养HL-1心肌细胞系，使用Adv-ShMARCH2腺病毒敲低MARCH2后PE刺激HL-1心肌细胞，48小时后检测MARCH2、Bax、Bcl2和C-caspase3凋亡相关蛋白水平。 结果:1.终末心衰病人较正常对照组心肌组织MARCH2蛋白水平明显下调，石蜡固定组织切片免疫组化结果显示MARCH2蛋白在心肌组织中明显下调;RT-q PCR检测心衰组织中ANP、BNP基因表达水平升高，MARCH2蛋白水平与ANP、BNP基因表达水平呈负相关。2.随着TAC造模时间的延长，TAC术后小鼠心肌组织MARCH2蛋白水平逐渐下调;且分离成年小鼠心肌细胞和非心肌细胞分析发现MARCH2蛋白主要在心肌细胞中下调。3.PE刺激HL-1心肌细胞48小时后MARCH2蛋白水平表达明显下调。4.MARCH2过表达改善TAC术后小鼠射血分数(EF)、缩短分数(SF)、收缩期心肌内径( LVIDs)、心输出量，并显著降低心肌细胞横截面积大小、纤维化面积和心肌细胞凋亡率，但不影响小鼠血压。5.MARCH2过表达改善PE刺激HL-1心肌细胞系诱导心衰细胞模型中细胞凋亡率，PE刺激HL-1心肌细胞48小时后MARCH2、Bcl2蛋白水平表达明显下调，Bax、C-caspase3蛋白水平明显升高，MARCH2过表达可以抑制Bax和C-caspase3凋亡蛋白水平升高，抗凋亡蛋白Bcl2也有一定升高。6.Seahorse检测发现MARCH2过表达在一定程度上改善原代小鼠心肌细胞线粒体呼吸功能，最大耗氧量以及剩余呼吸能力有一定程度回升。7.MARCH2敲除进一步加重TAC术后小鼠心脏结构和功能恶化，射血分数(EF)和缩短分数(SF)进一步降低，心肌细胞横截面积大小、纤维化面积和心肌细胞凋亡率进一步加重。8.MARCH2敲低进一步加重PE刺激HL-1心肌细胞系诱导心衰细胞模型中细胞凋亡率，Bax和C-caspase3促凋亡蛋白水平升高，抗凋亡蛋白Bc12进一步降低。 结论:MARCH2蛋白在心衰心肌组织中表达下调，并且与ANP、BNP基因表达水平呈负相关，参与心力衰竭的发生发展过程。过表达MARCH2可以改善TAC术后诱导的心脏重构，MARCH2敲除则加重心脏重构。 第二部分MARCH2通过泛素化稳定SNX5增加Flt3细胞膜转位改善压力超负荷诱导心衰小鼠中心脏重构 目的:探究MARCH2下游通过何种机制改善压力超负荷诱导心衰中心脏重构？ 方法:首先利用单细胞测序获得WT和MARCH2 KO小鼠TAC术后8周差异基因，通过蛋白marker分析富集到的细胞类型，再通过差异基因富集分析和GSEA富集分析MARCH2蛋白主要调控的下游信号通路。接下来分离成年小鼠心肌细胞的总膜(TM)、质膜(PM)、内体(ES)和其他成分膜(OM)检测MARCH2蛋白在细胞内定位情况。同时利用酵母双杂交和免疫共沉淀质谱分析寻找和MARCH2相互结合蛋白;进一步利用Co-IP、GST-pulldown及免疫荧光共定位验证MARCH2和SNX5的相互结合。我们采用Deletion mapping法构建MARCH2和SNX5的结构域突变质粒(MARCH2-WT, MARCH2-Delta 1-55aa, MARCH2-Delta 56-116aa, MARCH2-Delta117-214aa, MARCH2-Delta 215-246aa; SNX5-WT, SNX5-Delta 1-168aa, SNX5-Delta 169-404aa)，利用Co-IP进一步验证两者间的结合及结合的具体结构域。进一步构建Flag-Ub、Myc-MARCH2、Myc-MARCH2 CS突变质粒和HA-Ub-WT、HA-Ub-K0、HA-Ub-K6、HA-Ub-K11、HA-Ub-K27、HA-Ub-K33、HA-Ub-48、HA-Ub-K68泛素突变质粒，探究MARCH2对SNX5的具体泛素化修饰类型。 结果:1.单细胞测序差异基因富集分析和GSEA富集分析发现TAC术后后囊泡介导的转运相关信号通路明显抑制，MARCH2 KO进一步抑制囊泡介导的转运相关信号通路，这一研究表明囊泡介导的转运相关信号通路可能在TAC术后中发挥一定作用。2.分离成年小鼠心肌细胞的总膜(TM)、质膜(PM)、内体(ES)和其他成分膜(OM)亚定位分析发现MARCH2主要在ES中表达。3.酵母双杂交和免疫共沉淀质谱分析提示MARCH2和SNX5蛋白结合，Co-IP、GST-pulldown及免疫荧光进一步验证MARCH2和SNX5两者之间的结合。4.GST-pulldown实验验证MARCH2 1-55和SNX5 1-198氨基酸序列的结构域突变后，两者的结合均明显减弱，提示MARCH2 1-55与SNX5 1-198氨基酸序列的结构域介导二者的结合。 结论:MARCH2通过对SNX5上第118位点赖氨酸残基进行K27多聚泛素化稳定SNX5，SNX5下游通过促进Flt3细胞膜转位激活Akt信号通路改善压力超负荷诱导心衰。
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