摘要
蛋白质翻译是中心法则的最后一步，将mRNA中的遗传信息通过tRNA转换为氨基酸的序列。在生物中，从mRNA到蛋白质合成这一步需要极其精密复杂的翻译过程，该过程包含了翻译的起始、延伸和终止。翻译的起始包括蛋白质翻译起始复合物的组装，以及mRNA在核糖体中准确定位等过程。其中，翻译起始是蛋白质翻译过程中最关键的限速步骤。真核生物翻译起始因子eIF4A1是最早被发现的DEAD-box RNA解旋酶超家族的成员，具有RNA解旋酶和ATP酶活性。eIF4A1可以和eIF4G和eIF4E形成eIF4F翻译起始复合物，结合到mRNA的帽子结构上，促使5''UTR的解旋，起始蛋白翻译。靶向翻译起始的调控是最快速、最系统的调控基因表达的一种方式。因此，对翻译起始复合物的翻译后修饰调控研究是该领域的热点科学问题。 在本实验室的前期研究中，我们首次发现eIF4A1存在泛素化修饰，并鉴定到了 eIF4A1的一个去泛素化酶USP9X,它可以通过去泛素化eIF4A1来稳定eIF4A1。并且，通过质谱鉴定，我们还发现了 eIF4A1的第369位赖氨酸上存在多聚泛素化修饰。但是，目前尚未有文献报道eIF4A1的E3泛素连接酶。 在前期研究的基础上，我们首先发现E3泛素连接酶HECT家族NEDD4亚家族中的SMURF1和SMURF2能和eIF4A1发生相互作用，且SMURF1与eIF4A1的结合强于SMURF2。通过鉴定互作结构域，我们发现eIF4A1结合SMURF1/2的C端HECT酶活催化结构域，提示SMURF1/2是eIF4A1潜在的E3泛素连接酶。通过查询泛素化修饰数据库，我们拟定了 14个eIF4A1潜在的泛素化位点，并通过构建突变体进行验证。我们发现SMURF1能对eIF4A1第381位赖氨酸进行泛素化修饰。并且有意思的是，SMURF1对eIF4A1的修饰应该是单泛素化的修饰类型。我们通过SMURF1和eIF4A1的体外泛素化实验，证实了 SMURF1对eIF4A1进行单泛素化修饰。另外，我们通过Lys-free的Ub突变质粒和eIF4A1的IP实验发现，eIF4A1存在两个泛素化修饰位点，K381和K369。K381介导SMURF 1对eIF4A1的单泛素化修饰，K369介导eIF4A1的多聚泛素化修饰，二者之间可能存在相互调控的精细作用模式。最后，通过对SMURF1调控eIF4A1的功能进行检测，我们发现在敲除SMURF 1后，依赖于eIF4A1翻译起始调控的新生蛋白合成减少，并且SMURF1缺失细胞系的增殖速率显著变慢。原癌基因c-Myc和XIAP是依赖于eIF4A1调控的下游蛋白，在敲除SMURF 1的细胞中，c-Myc和XIAP蛋白的表达也有所减少。 综上所述，本研究证实了 SMURF1和eIF4A1相互作用，可以单泛素化修饰eIF4A1的第381位赖氨酸，并调节eIF4A1介导的蛋白质翻译起始。这不仅揭示了翻译起始因子存在泛素化修饰，为靶向翻译起始过程提供了新的视野，还提示我们单泛素化具有迥异于 K48型多聚泛素化降解的功能，扩大了我们对泛素化修饰的认识。
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