摘要
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii）是一种单细胞真核藻类，其作为模式生物，在分子遗传学和生产重组蛋白的领域均受到了极大的关注，享有“光合酵母”的称号。虽然莱茵衣藻在遗传表达上有着巨大的发展潜力，但在细胞培养领域可达到的生物量远低于其他经济微藻。莱茵衣藻自养培养受制于光照的影响，生物量最大产量通常为1-2 g/L。在异养培养模式下，培养体系内的底物抑制作用一直是莱茵衣藻高密度培养需要突破的难关，目前所报道的莱茵衣藻最高生物量为25.44 g/L,最大平均生物质产率为106 mg/L/h,碳源（乙酸）转化率为26％,远远不能满足产业化需求。要想进一步推动莱茵衣藻产业的发展，必须要实现其高密度培养和高产率输出，探索一种新的莱茵衣藻培养工艺。基于以上研究背景，本研究筛选了一株在黑暗环境下可以利用碳源异养生长的优势莱茵衣藻藻株，在三角瓶内优化其异养培养工艺，探究最佳补料策略和补料培养基成分，并在7.5 L发酵罐上进行验证。其次，通过优化补料碳氮比来提高藻粉蛋白质含量，为莱茵衣藻在异养条件下高效生产重组蛋白奠定技术基础。 本研究的主要结果如下: 1.基于生物量、平均生物质产率和碳源转化率进行异养筛选，在19株莱茵衣藻藻株中挑选出了 GUN4和CC124。探索出了两者在250 mL摇瓶内的最适培养条件:在TAP培养基的基础上，使用87.5 mM的乙酸作为碳源，使用氢氧化钠调节体系初始pH,氯化钠浓度不宜超过70mM，使用氯化铵作为氮源，氮源浓度不宜超过7mM，培养温度设置为30 ℃。CC124置于黑暗摇床中培养3天左右，可达到的最大生物量为1.91 g/L,平均生物质产率为722 mg/L/d。GUN4置于黑暗摇床中培养2天左右，可达到的最大生物量为2.03 g/L,平均生物质产率为 866 mg/L/d。 2.绘制了 CC124和GUN4底物相关的生长动力曲线，得出了比生长速率较高的碳氮源浓度区间，并探究出了莱茵衣藻异养培养的补料策略和补料成分。实验发现，当体系碳氮比为16-24时，碳源和氮源的消耗比例适宜，铵态氮不会积累过剩，培养过程中体系pH呈上升趋势。故提出猜想:使用乙酸与乙酸铵作为补料的碳氮源，将补料定性为酸性，维持体系内碳氮比为16-24。在摇瓶规模上对补料猜想进行验证，发现CC124经过四次补料，最大生物量达到2.8 g/L,GUN4通过三次补料，最大生物量达到3.4 g/L,证实了补料方法的可行性。 3.在7.5 L发酵罐中对培养工艺进行了验证实验。培养温度为30 ℃,使用pH恒定补料方式，罐内溶氧设定为20％，罐内底料含有87.5 mM乙酸盐和7 mM的氯化铵，分别作为培养所需的碳源与氮源，其余成分与TAP培养基相同。补料使用50倍浓缩TAP培养基，并在此基础上添加了 1 kg的冰乙酸和105 g的乙酸铵作为碳氮源，补料碳氮比为20。CC124通过156 h的培养，最终生物量达到32g/L,平均生物质产率达到205 mg/L/h,GUN4通过156h的培养，最终生物量达到53.85 g/L，平均生物质产率达到345 mg/L/h。后续进行补料碳氮比优化，发现当补料碳氮比为16时，经过108 h的培养，GUN4最大生物量达到了 47g/L，平均生物质产率达到了 416 mg/L/h。GUN4藻粉的蛋白质含量提高到了 36％,达到了国家卫检委食品原料添加的标准。同时，培养过程中碳源的转化率提高到了51％,相比文献报道的26％，实现了翻倍，进一步缩减了生产成本。在相同的培养规模下，GUN4的生物量和平均生物质产率结果分别是目前文献报道的2.1倍和3.2倍。 本研究建立了稳定的莱茵衣藻异养培养工艺，为后续莱茵衣藻的产业化提供了技术基础。通过优化补料策略和补料成分，有效避免了金属阳离子（Na+）的大量积累对细胞生长的抑制。同时，大幅缩短了每个培养批次的时间。本研究实现了莱茵衣藻产量和产率的双突破，获得了莱茵衣藻异养高密度发酵生产蛋白的最适培养条件，为后续打开莱茵衣藻相关产品市场奠定了基础。
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