摘要
背景与目的:结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其中10％的结直肠癌患者具有 BRAF(B-Raf Proto-Oncogene,Serine/Threonine Kinase)基因的突变。BRAFV600E突变的结肠癌是预后最差的一种肠癌类型，具有高转移性、生存期短、化疗药物治疗不敏感的临床特征。减少BRAFV600E突变导致的结直肠癌进展和转移对于提高患者预后有关键作用。肿瘤细胞在转移过程中面对营养缺乏、氧化应激升高等恶劣生存条件会通过改变自身的代谢方式与代谢途径来适应这种压力,这一过程叫做代谢重编程。越来越多的研究证明代谢重编程在肿瘤转移中扮演着重要的角色，BRAFV600E突变的结直肠癌患者中占70％的BM2亚型富含代谢过程，而BRAFV600E突变在结直肠癌代谢中所扮演的角色尚不清楚，从BRAFV600E突变与代谢重编程之间的关系来探讨结直肠癌转移的相关研究目前也较少。因此，本研究旨在寻找BRAFV600E突变驱动何种代谢重编程来影响结直肠癌转移，之后对其进行干预从而达到抑制肿瘤转移的治疗效果，最后对其中的机制进行初步探索，为BRAFV600E突变的结直肠癌治疗提供一种新思路。 材料与方法:我们通过临床样本蛋白组学和细胞样本代谢组学确定了BRAFV600E驱动的代谢重编程特征。通过细胞学实验、谷胱甘肽含量测定、活性氧(ROS)测定实验研究了 BRAFV600E突变驱动的代谢重编程对肿瘤转移的影响。我们在细胞、类器官、动物等体内体外模型中对BRAFV600E突变驱动的代谢重编程进行干预，以此来研究不同治疗方案对肿瘤转移的抑制效果。最后我们通过细胞蛋白组学、siRNA干扰等实验初步探索了 BRAFV600E突变驱动代谢重编程促进肿瘤转移过程中的关键蛋白，通过利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析了该蛋白与BRAFV600E突变的结直肠癌患者临床特征以及预后的关系。 结果:首先，我们收集了在本中心接受手术治疗的30名BRAFV600E突变的结直肠癌患者和30名非BRAFV600E突变的结直肠癌患者的癌组织与癌旁组织样品，提取蛋白质后进行蛋白组学分析。我们发现BRAFV600E突变导致多种代谢相关蛋白表达上调，其中包括谷胱甘肽代谢通路的关键酶GPXI(Glutathione Peroxidase 1)。接下来，我们构建了 BRAFV600E突变的稳转株，对蛋白组学发现的结果在mRNA水平上进行了验证。我们通过细胞代谢组学分析，发现BRAFV600E突变可以增强谷胱甘肽代谢和嘌呤嘧啶代谢，随后我们在稳转株中通过测定谷胱甘肽代谢物含量验证了这一发现。我们通过运用H2O2模拟转移过程中的氧化应激状态研究了 BRAFV600E突变驱动的谷胱甘肽代谢增强与肿瘤转移之间的关系，发现BRAFV600E稳转株在高氧化应激状态(900μM H2O2)下维持了较低的活性氧(ROS)水平，使其仍保持较强的迁移与侵袭能力。之后，我们利用细胞、类器官、裸鼠模型进行体内外实验对BRAFV600E突变驱动的代谢重编程进行干预，发现相较于单用传统的化疗药物或BRAFV600E抑制剂PLX4720,联合使用谷胱甘肽代谢抑制剂及嘌呤嘧啶代谢抑制剂可以有效地抑制肿瘤转移。最后，我们初步探索了 BRAFV600E突变驱动代谢重编程促进结直肠癌转移的可能机制，我们通过细胞蛋白组学发现，BRAFV600E突变导致APIP(APAF1 Interacting Protein)蛋白表达增加，这种改变在高氧化应激状态下更为明显。随后我们通过siRNA干扰实验降低了 RKO细胞中APIP的表达，发现敲减APIP后细胞侵袭能力下降，甲硫氨酸和谷胱甘肽含量下降，ROS水平升高，这种改变在高氧化应激状态下更为明显。我们通过用不同浓度的ERK(Extracellular regulated protein kinases)抑制剂处理细胞，发现 APIP 的表达随磷酸化ERK水平的升高而增加，从而间接说明BRAFV600E突变通过促进RAF-MEK-ERK轴中ERK的磷酸化来增加APIP的表达。我们利用TCGA数据库分析了 APIP表达对BRAFV600E突变的结直肠癌患者的影响，我们发现高表达APIP的BRAFV600E突变结直肠癌患者肿瘤转移风险更高、预后更差。 结论:在本研究中，首先，我们发现了 BRAFV600E突变驱动结直肠癌代谢重编程的特征是谷胱甘肽代谢和嘌呤嘧啶代谢增强，增强的谷胱甘肽代谢使BRAFV600E突变的结直肠癌能在高氧化应激状态下维持较低的活性氧水平，从而促进肿瘤转移。接下来，我们发现了常规化疗或BRAFV600E抑制剂联合干预代谢重编程的治疗方案可以有效地抑制肿瘤转移。最后，我们初步探索了BRAFV600E突变驱动代谢重编程促进结直肠癌转移的可能机制，发现这可能与BRAFV600E突变通过促进RAF-MEK-ERK轴中ERK的磷酸化来增加APIP的表达相关。这些发现为BRAFV600E突变的结直肠癌治疗提供了新思路。
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