摘要
多肽、抗体和疫苗等生物大分子药物在疾病的治疗过程中发挥着重要的作用，是当前最具发展前景的领域之一。目前，生物大分子的临床应用存在着稳定性差与生物利用度较低等挑战，开发高效的体内递送系统对于提高其体内稳定性与生物利用度有着重要意义。相比于无机材料和有机材料，基于生物材料的药物递送系统在生物相容性、长效血液循环、基因可编程改造等方面存在着独特的优势。特别是基于哺乳动物细胞的细胞膜结构的生物材料，由于生物安全性高、易于改造和可大批量制备等优势，受到了研究者的广泛关注。 细胞膜是由脂质和蛋白质组成的磷脂双分子层结构，流动性较好，是天然的蛋白质镶嵌平台。得益于分子生物学的发展，可以通过基因工程改造的方式在细胞膜的表面定向表达相应的功能蛋白，如多肽、抗体等，从而实现生物大分子药物递送载体的构建。将生物大分子展示在细胞膜上可以维持它们的天然构象与生物学活性，具备较高的临床转化价值。此外，可以通过生物工程化的方法制备纳米级的仿生细胞膜囊泡(membrane vesicles,MVs)，并将其装载药物后构成功能复合物。基于细胞膜展示技术的功能复合物可以实现多种治疗方式的联合，并解决单一治疗方式效果有限且易产生耐受性等难题。在本论文中，我们利用细胞膜展示技术构建了两种新型抗体递送系统，并将其用于肿瘤的联合治疗领域。本论文包括以下两个部分的内容: (1)基于细胞膜展示技术，我们利用基因工程的手段将特异性结合肝癌表面标志物GPC3的单链抗体hGC33 scFv与具有抗肿瘤活性的蜂毒肽melittin通过MMP14酶切的连接子进行重组后，构建了一种膜上展示重组蛋白hGC33 scFv-melittin的仿生细胞膜纳米囊泡。将其作为药物递送系统分别装载小分子化疗药物DOX和纳米化的声敏剂nP18(分别标记为DOX@hGC33 scFv-melittin MVs和nP18@hGC33 scFv-melittin MVs)，用于肝癌的联合治疗。在这项研究中，抗体的偶联避免了蜂毒肽静脉注射时的脱靶毒性，且该工程化的细胞膜囊泡可以显著增强所装载药物在肿瘤区域的富集，体现了较好的靶向性。通过体外细胞实验，证明了我们构建的基于细胞膜展示技术的功能复合物可以增强肿瘤细胞对药物的摄取，并达到减毒增效的目的;通过体内动物实验，证明了在联合策略下，我们构建的基于细胞膜展示技术的功能复合物可以显著抑制肿瘤的生长。 (2)基于细胞膜展示技术及天然仿生策略，我们提出了一种包膜上展示外源性目标蛋白的嵌合流感病毒制备方法。具体地，可以将流感病毒包膜上的三聚体蛋白血凝素(HA)的头部HA1亚基替换成目标三聚体抗原并将其与HA2亚基进行重组;然后将重组蛋白通过基因工程的手段过表达在流感病毒宿主细胞的细胞膜上;最后，借助于流感病毒通过出芽的方式完成复制，将流感病毒感染上述改造过的宿主细胞，子代病毒出芽时会劫持宿主细胞细胞膜，从而构建包膜上展示外源性重组蛋白的嵌合流感病毒。作为概念验证，我们首先构建了基于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)的嵌合病毒RBD-HA2，并初步验证了这种蛋白递送方法的可行性。基于上述所提出新方法的普适性，我们将抗PD-1单链抗体过表达在流感病毒宿主细胞的细胞膜上，利用流感病毒出芽现象制备了包膜展示抗PD-1单链抗体的嵌合流感病毒，并将其用于肿瘤的免疫治疗。一方面，流感病毒可以作为免疫刺激剂，瘤内注射时可以激活肿瘤局部区域的免疫应答，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤;另一方面，抗PD-1单链抗体可以阻断PD-1/PD-L1信号通路，恢复耗竭型T细胞的正常功能。在动物实验中，我们证实了该功能复合物有效抑制了肿瘤的生长，且这种肿瘤治疗效果不受流感病毒预存免疫的影响。
NETL