摘要
浮萍是世界上生长速度快、形态结构及基因组极简的单子叶开花植物，其可以作为底盘植物表达外源蛋白。它可以高效地吸收废水中的富营养物质，如氮、磷，从而遏制水体富营养化，是一种环境友好型的植物资源。在特定条件下，浮萍可以将光合作用产生的糖高效地合成淀粉，可作为一种新型的生物质能源。在植物中，淀粉是能源储存的终极形式，而蔗糖可以为淀粉合成提供原料，同时，蔗糖还可以为植物生长发育提供能量和渗透压。叶肉细胞中产生的蔗糖被转运到植物不同组织中发挥相应的作用，在蔗糖转运的过程中需要蔗糖转运蛋白的参与和调控，而浮萍中蔗糖转运蛋白的功能及其调控蔗糖机制尚不清楚。浮萍遗传转化体系是解析基因功能的基础和植物生物反应器应用的前提。植物生物反应器应用的关键是外源蛋白的高效表达，其中启动子对于基因表达量至关重要。目前使用最广泛的病毒源的35S启动子存在一定局限性，包括影响相邻基因的表达、在单子叶植物中活性低等。因此，可广泛应用于单子叶和双子叶植物的内源性强启动子亟待挖掘。 本研究的目的是构建少根紫萍 Landoltia punctata 0202(Lp0202)和多根紫萍Spirodela polyrhiza 7498(Sp7498)的遗传转化体系，并从少根紫萍中筛选内源性强启动子，并对LpSUT2启动子表达的基因蔗糖转运蛋白基因(sucrose transporter 2 of Landoltia punctata,LpSUT2)进行体内和体外功能表征和解析。同时，以该株系为研究对象挖掘浮萍内源性强启动子，拓宽启动子资源库。本研究为浮萍通过基因工程手段进行基因改造和功能验证提供了理论依据，同时也为浮萍作为植物生物反应器提供了启动子元件。具体研究内容如下: (1)农杆菌介导浮萍遗传转化体系的构建。本研究对少根紫萍Lp0202和多根紫萍Sp7498愈伤组织诱导进行优化，其中少根紫萍在1 mg/L的6-苄氨基嘌呤、15 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和1％的山梨糖醇的MS基础培养基中成功诱导出愈伤组织，其愈伤组织诱导率约为100％;多根紫萍在0.2 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.45 mg/L噻苯隆、2 mg/L萘乙酸和3％蔗糖的MS基础培养基中成功诱导出愈伤组织，其诱导率约为100％。少根紫萍和多根紫萍诱导的愈伤经形态学和组织学鉴定该愈伤组织为胚性愈伤组织，都能进一步分化为完整植株。少根紫萍和多根紫萍的愈伤组织最佳再生基础培养基分别为MS培养基(1％山梨糖醇)和SH培养基(2.19 mg/L玉米素和1％蔗糖)，且再生率均为100％，再生周期分别为90 d和40 d。为评估农杆菌侵染愈伤组织的效率，将含gus报告基因的载体pCambia2301-GUS通过农杆菌介导转入少根紫萍和多根紫萍的愈伤组织，其瞬时转化效率分别为20％和35％。 （2）LpSUT2启动子活性分析。通过使用35S启动子和浮萍6个内源性启动子在双子叶植物烟草中瞬时表达egfp,发现LpSUT2启动子与35S启动子的活性相当。在单子叶植物浮萍中，采用不同浓度的筛选剂G418（50、100、200、300、400 和 500 mg/L）对 pro35S:eGFP 和 proLpSUT2:eGFP 转基因进行筛选和再生。qRT-PCR和eGFP荧光信号结果表明，随着筛选剂G418浓度的增加，35S启动子活性逐渐降低，而LpSUT2启动子活性整体上不受筛选剂G418浓度的影响。此外，顺式作用元件分析发现 LpSUT2启动子中具有增强子功能的顺式作用元件（CAAT-Box、G-Box和as-1）的拷贝数多于35S启动子。进一步通过pro35S:eGFP和proLpSUT2:eGFP转基因植物的转录组分析LpSUT2启动子活性的潜在调控机理，结果表明在筛选剂G418浓度分别为100 mg/L和500 mg/L时，LpSUT2启动子的活性分别是35S启动子活性的1.76倍和6.18倍。当筛选剂G418的浓度从100 mg/L增加到500 mg/L时，pro35S:eGFP转基因株系中的nptⅡ基因表达量显著上调，且与具有增强子功能的顺式作用元件结合的转录因子GBF、NF-Y和ASF-1的表达水平没有显著差异，表明植物体内转录因子在转录水平保持恒定。随着筛选剂G418浓度的增加，驱动筛选标记基因nptⅡ表达的35S启动子可能会结合更多的转录因子促进nptⅡ基因的转录，而驱动egfp基因表达的35S启动子可能结合少量的转录因子，最终导致nptⅡ基因表达量上调，而egfp表达量下调。当驱动egfp表达的35S启动子被替换为LpSUT2启动子时，由于LpSUT2启动子区转录因子结合位点的数量比35S启动子区多，它可能竞争更多的转录因子来维持其高活性。 （3）LpSUT2生物信息学分析。基于少根基因组同源分析发现LpSUT2为单拷贝基因。通过基因比对和系统发育树构建分析少根紫萍蔗糖转运蛋白SUT2属于SUT蛋白家族中ⅡA型蛋白（SUT2亚家族）。同时，对LpSUT2蛋白结构分析，结果表明LpSUT2蛋白是一个含有12个跨膜结构域的质膜蛋白。进一步通过CB-Dock在线数据库模拟分析，该蛋白的N端氨基酸序列含有13个潜在的关键氨基酸位点，它们可能与该蛋白转运蔗糖的功能相关。 （4）LpSUT2蛋白体内和体外功能验证。通过亚细胞定位和组织定位实验表明LpSUT2蛋白定位于所有组织细胞质膜。体外酵母互补实验表明LpSUT2蛋白具有将胞外蔗糖转运至胞内的功能。浮萍M0157体内LpSUT2基因过表达后的转基因株系在第10 d时淀粉含量是野生型的2.01倍。此外，LpSUT2蛋白组织定位结果表明LpSUT2蛋白在保卫细胞中高表达。同时，在发育过程中LpSUT2基因过表达株系的气孔开度逐渐减小、蔗糖含量减少、保卫细胞中ROS含量增加，且LpSUT2:eGFP融合蛋白在保卫细胞膜发生了局部内吞，呈现极性分布:在发育初期，保卫细胞质膜上LpSUT2:eGFP融合蛋白均匀分布，而在发育成熟后，LpSUT2:eGFP融合蛋白只分布在保卫细胞内膜，而外膜中的蛋白发生局部内吞作用。400 mM蔗糖处理野生型浮萍后，也观察到气孔开度减小、保卫细胞中ROS含量增加，与LpSUT2基因过表达株系中观察的结果一致。综上，LPSUT2基因表达量上调后导致保卫细胞中形成糖胁迫，产生信号分子ROS，进一步激活保卫细胞中LpSUT2蛋白的局部内吞作用，从而导致了保卫细胞中渗透压减小，保卫细胞失水，最终引起气孔开度减小。 本研究全面系统地分析了能源植物浮萍LpSUT2基因功能及其启动子活性。研究表明LpSUT2蛋白可以提高浮萍淀粉含量，为进一步推动浮萍作为生物燃料的利用奠定一定的理论基础。同时，LpSUT2过表达株系在发育过程中使气孔开度减小。这对陆生植物抗旱提供了一定的理论依据，通过基因工程手段改造该基因，具有增强植物抗旱能力的潜力，提高水分利用率，降低水资源的消耗，进而缓解全球水资源匮乏的问题。植物气孔开度减小，对抗病原体入侵、防止昆虫取食或产卵也提供了一定的理论基础。此外，LpSUT2内源性强启动子的挖掘及其表征，为进一步利用基因工程手段改造植物功能性基因提供了一个很好的元件。例如，利用该强启动子过表达抗旱、耐盐、抗逆等关键基因，从而提高植物对环境的适应能力，或利用该强启动子在植物体内过表达吸附重金属、富营养物质（氮、磷）等关键基因，以提高植物对水体或土壤的修复能力。
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